SN T 5175-2021 国境口岸蚊类DNA条形码鉴定规程.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5175 2021 国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定规程 Identification codes for mosquitos with DNA barcoding at frontier ports ICS 11.020 CCS C 62 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5175 2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 请注意本文件的某

2、些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关。 本文件起草人：高 博、方义亮、张建庆、王宇平、黄恩炯。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5175 2021 国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定规程 1范围 本文件规定了国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定方法中 DNA 提取、基因的扩增及序列的比对分析、 结果判定等。 本文件适用于国境口岸蚊类中成虫、幼虫、蛹、残肢不全等标本的 DNA 条形码鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

3、其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB 19489实验室生物安全通用要求 SN/T 1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程。 SN/T 2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第 4 部分：实验室人员 SN/T 4278国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程 WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 ITS2 基因 ITS2 gene ITS2 基因核糖体内转录间隔区 2，变异速度适中，能够提供较丰富的变异位点和信息位点

4、，位于 5.8 S 与 28 S 之间，可应用于种团、复合体之间进行鉴定。 4方法原理 基于线粒体 COI 基因序列对蚊类进行鉴定，确定种内差异、种间差异，结合核糖体 ITS2 基因对 种团、复合组进行鉴定。 5仪器设备、试剂与实验准备 5.1仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、离心机、微量分光光度仪、PCR 仪、电泳设备、凝胶成像系统等。 5.2主要试剂 动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA 标准分子量标（DL2000） 以正式出版文本为准 2 SN/T 5175 2021 5.3实验准备 实验室生物安全符合 GB 19489 和 SN/T 2752.4 的

5、规定；PCR 防污染措施遵照 WS/T 230 的要求 执行。 6鉴定方法 6.1取样 标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组 织（如单侧蚊足）置于灭菌的洁净 1.5 mL 离心管留用，如长期不用需放置体积分数为 90% 以上乙 醇 -20保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本。 6.2凭证标本制作 将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照 SN/T 1876 的要求执行。 6.3DNA 制备 将单份样品（成虫、幼虫、蛹）置于已灭菌的洁净 1.5 mL 离心管后用研磨棒研磨，利用商品化 昆虫 DNA 提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为

6、单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹 部）后再研磨）；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于己灭菌的洁净 1.5 mL 离心管后用研磨棒 研磨，利用微量组织 DAN 提取方法（见附录 A）进行蚊虫基因组的制备，制备好的 DNA 进行浓度及 纯度测定后，保存至 -20冰箱备用。 6.4 COI 序列扩增 利用通用引物进行 COI 序列扩增（见附录 B）、测序，测序结果在中国检疫性有害生物 DNA 条形 码鉴定系统中进行比对（见附录 C）。 6.5 ITS2 序列扩增 根据序列 COI 结果判定困难的，同时属于蚊类种团、复合组目录（见附录 D）中的蚊种可以通 过 ITS2 通用引物进行扩增（

7、见附录 E）、测序，测序结果在中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系 统中进行比对（见附录 C）。 6.6结果判定 COI 序列长度电泳条带在 750 bp 左右，ITS2 序列长度电泳条带在 500 bp 左右，在中国检疫性有 害生物 DNA 条形码系统进行比对，若与数据库中蚊种序列同源性大于等于 98%，则判定该蚊种和数 据库中的蚊种为同一种。也可以在 BOLD、NCBI 比对，具体按 SN/T 4278 规定执行。 6.7样本保藏 对同一批中相同形态特征的蚊种数量较多情况下，除了作为核酸提取的标本外，其它根据 SN/T 1876 进行标本制作和保存，提取后核酸和扩增产物除一部分送测序外

8、，剩下的分别做好标记并保存 于 -80超低温冰箱作为凭证样本，以便复核。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5175 2021 附录A （资料性） 微量组织 DNA 提取方法 A.1配置裂解液 配置 100 mL 裂解液（10 mmol/L Tris-HClpH 8.0，1 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40，100 u g/ mL 蛋白酶 K） A.2热裂解 吸取 35 L 儿裂解液，加样匀浆，加 35L ddH20，煮沸 5 min。 A.3离心 10000 r/min 离心 10 min，取上清备用。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5175 2021 附录B （规

9、范性） COI 序列扩增流程 B.1引物序列 LCO1490:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 HCO2198:5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 B.2PCR 体系 推荐用 50 L 体系，引物浓度为 10 M，模板可用提取的蚊虫 DNA 10 100 ng，可用商品化的 PCR mix。 B.3扩增程序 第一步：945 min; 第二步：9530 s，46 30 s，72 40 s，35 个循环： 第三步：727 min。 B.4电泳及测序 5 L PCR 产物，质量浓度为 1.5% 琼脂糖，PCR 产物大小：约 750 bp。测序引物为

10、 LCO1490 或 HCO2198，双向测序。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5175 2021 附录C （资料性） 序列比对 C.1进入网站 http:/qbol.apqchina.org/，进入网站的主页： C.2点击菜单识别物种，提交序列 选择菜单动物鉴定，然后点击下拉菜单，选择提交序列类型（COI/ITS），然后输入 fasta 格式的 序列，最后点击提交鉴定。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5175 2021 附录D （资料性） 口岸常见蚊类种团、复合组以及种类 表 D.1口岸常见蚊类种团、复合组以及种类 种团、复合组 种类 赫坎按蚊种团 Anopheles hyrcanu

11、s group 雷氏按蚊 Anopheles lesteri Baisas et Hu,1936 克劳按蚊 Anopheles Crawfordi Reid,1953 带足按蚊 Anopheles peditaeniatus Leicester,1908 中华按蚊 Anopheles sinensis Wiedemann,1828 类中华按蚊 Anopheles sineroides Yamada,1924 须喙按蚊种团 Anopheles barbirostris group 须喙按蚊 Anopheles barbirostris Van der Wulp,1884 五斑按蚊种团 Anoph

12、eles maculipennis group 米赛按蚊 Anopheles messeae Falleroni,1926 林氏按蚊种团 Anopheles lindesayi group 林氏按蚊 Anopheles lindesayi Giles,1900 巨型按蚊种团 Anopheles gigas group 巨型按蚊贝氏亚种 Anopheles gigas baileyi Edwards,1929 艾氏按蚊种团 Anopheles atikeni group 孟加拉按蚊 Anopheles bengalensis Puri,1930 金条伊蚊组 Aedes aureostriarus

13、 group 金条伊蚊卡那拉亚种 Aedes aureostriarus kanaranus Barraud,1924 金线伊蚊亚组 Aedes chrysolineatus subgroup 金线伊蚊 Aedes chrysolineatus Theobald.1907 台湾伊蚊 Aedes formosensis Yamada,1921 哈维伊蚊 Aedes harveiyi Barraud,1923 日本伊蚊 Aedes japonicus Theobald,1901 朝鲜伊蚊 Aedes koreicus Edwards,1971 石穴伊蚊 Aedes saxicola Edwards

14、,1922 以正式出版文本为准 7 SN/T 5175 2021 种团、复合组 种类 东乡伊蚊亚组 东乡伊蚊 Aedes togoi subgroup Aedes togoi Theobald,1907 异形伊蚊组 Aedes dissimilis group 云南伊蚊 Aedes yunnanensis Gaschen,1934 乳点伊蚊组 Aedes macfarlanei group 棘刺伊蚊 Aedes elsiae Barraud,1923 白雪伊蚊亚组 Aedes niverus subgroup 侧白伊蚊 Aedes albolateralis Theobald.1908 里海伊

15、蚊组 Aedes caspius group 背点伊蚊 Aedes dorsalis Meigen,1830 埃及伊蚊组 Aedes aegypti group 埃及伊蚊 Aedes aegypti Linnaeus,1762 仁川伊蚊 Aedes chemulpoensis Yamada, 1921 圆斑伊蚊亚组 Aedes annandalei subgroup 圆斑伊蚊 Aedes annandalei Theobald,1910 白纹伊蚊亚组 Aedes albopictus subgroup 白纹伊蚊 Aedes albopictus Skuse,1894 亚白纹伊蚊 Aedes s

16、ubalbopictus Barraud,1931 原黑蚊组 Protomelanoconion group 短须库蚊 Culex brevipalpis Giles,1902 短须蚊组 Mochthogenes group 马来库蚊 Culex malayi Leicester,1908 乳突库蚊组 Culex mammilifer group 孟加拉库蚊 Culex bengalensis Barraud,1934 思茅库蚊 Culex szemaoensis Wang et Feng,1964 尖音库蚊组 Culex pipiens group 尖音库蚊 Culex pipiens Li

17、nnaeus,1758 致倦库蚊 C,ulex pipiens quinquefasciatus Say,1823 淡色库蚊 Culex pipiens pallens Coquillett,1898 迷走库蚊 Culex vagans Wiedemann,1828 希氏库蚊组 Culex theileri group 棕头库蚊 Culexuscocephala Theobald,1907 二带喙库蚊组 Culex bitaeniorhynchus group 二带喙库蚊组 Culex bitaeniorhynchus Giles,1901 续表 以正式出版文本为准 8 SN/T 5175 2

18、021 种团、复合组 种类 海滨库蚊亚组 Culex sitiens subgroup 五指库蚊 Culex barraudi Edwards,1922 环带库文 Culex annulus Theobald.1901 伪杂鳞库蚊 Culex pseudovishnui Colless,1957 三带喙库蚊 Culex tritaeniorhynchus Giles,1901 拟态库蚊亚组 Culex mimeticus subgroup 拟态库蚊 Culex mimeticus No,1899 棕盾库蚊 Culex jacksoni Edwards,1934 类拟态库蚊 Culex murr

19、elli Edwards,1968 小拟态库蚊 Culex mimulus Edwards.1915 续表 以正式出版文本为准 9 SN/T 5175 2021 附录E （资料性） ITS2 基因扩增程序 E.1引物序列 ITS2F 5-TGTGAACTGCAGGACACATG-3 ITS2R 5-AATGCTTAAATTTAGGGGGTA-3 E.2PCR 体系及扩增程序 推荐用 50 L 体系，引物浓度为 10 M，模板可用提取的蚊虫 DNA 10 100 ng，可用商品化的 PCRmix。 E.3扩增程序 第一步：945 min; 第二步：9530 s，4630 s，7240 s，35

20、个循环； 第三步：727 min。 E.4电泳测序 5 L PCR 产物，质量浓度为 1.5% 琼脂糖，PCR 产物大小：约 500 bp，测序引物为 ITS2F 或 ITS2R，双向测序。 以正式出版文本为准 SN/T 5175 2021 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 24 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175686 定价 18.00 元 国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定规程 行 业 标 准 SN/T 51752021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址