DB37 T 2031-2012 奶牛DNA亲子鉴定技术规程.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 20312012 奶牛 DNA亲子鉴定技术规程 Technical Specification for DNA Parentage Identification in Dairy Cattle 2012 - 02 - 09发布 2012 - 03 - 01实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/ T 20312012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜
2、牧总站、山东奥克斯生物技术有限公 司。 本标准主要起草人:黄金明、张思聪、鞠志花、李建斌、李荣岭、李秋玲、侯明海、曲绪仙、仲跻 峰。 DB37/ T 20312012 1 奶牛DNA 亲子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了奶牛DNA亲子鉴定的技术方法。 本标准适用于奶牛DNA亲子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 NY/T 1672-2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 SN/
3、T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T 1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲子鉴定 (parentage id entification) 利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。 3.2 亲权指数( paternity index,PI ) 假设亲代提供生父(母)基因成为孩子生父(母)的可能性和随机亲代亲提供生父(母)基因成为 孩子生父(母)的可能性的比值。 3.3 LOD 值 亲权指数的对数值。 3.4 亲权(父、母)相对机会(Relative c hance pater
4、nity,RCP) 表示疑似亲代是真实亲代的机会。 RCP的计算: DB37/ T 20312012 2 1+ = PI PI RCP .(1) 式中: PI亲权指数。 多个标记累计的PCP计算: RCPI)(RCP = 111累计 .(2) 式中: RCPi第 i标记的RCP。 3.5 微卫星 (DNA micro satellite) 也称短串联重复序列 (STR) 或简单重复序列(SSR)。是一类广泛存在于真核生物基因组中的,核心 序列为26bp, 重复次数通常为1530次的DNA串联重复序列。 3.6 多重聚合酶链反应(multiplex PCR) 又称多重引物PCR或复合PCR,是指
5、在同一 PCR反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸 片段的PCR反应。 4 鉴定原理 利用常染色体微卫星分型技术,选取不同染色体上的微卫 星位点,采用多重PCR技术扩增微卫星标 记,检测微卫星位点的遗传多态性,分型得出各位点等位基因的大小,通过软件统计分析,确定或排除 亲子关系。 5 主要试剂配制 除另有规定,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682的双蒸水;高压灭菌条件为1.034105Pa 压力,蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 7 检测方法 7.1 样本采集 静脉采集血样35 mL,ACD抗凝,4或-20保存。对公牛,亦可采集23剂细管
6、精液,液氮保存。 7.2 DNA 提取 DB37/ T 20312012 3 7.2.1 血液DNA 的提取 用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T 1917-2007 的规定执行。DNA的提取按照 NY/T 1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。 7.2.2 精液DNA 提取 从细管中取出精液放入1.5mL离心管中,然后,加入500 L生理盐水,混匀,12000 rpm离心1min, 弃除上清液,保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400 L及5 L蛋白酶K,旋 涡混合器悬浮;56消化101
7、2h,至溶液澄清透明;加入300 L苯酚,轻轻混匀,12000rpm离心10min; 小心吸取上清液,转至1.5mL离心管中,加入150 L酚和150 L氯仿,轻轻混合5min;吸取上清液,加入 500L 无水乙醇(4保存),轻轻颠倒混合;用灭菌枪头将白色沉淀挑出,1mL的70%乙醇洗涤,凉干, 加入400 L 双蒸水,充分溶解,4或-20保存。 7.3 DNA 浓度和纯度检测 按照 NY/T 1672-2008的规定执行。 7.4 引物序列 引物序列参考联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)的推荐引物。 12个微卫星标记分为4 个扩增组合,具体见附录C。 7.5 PCR 扩增
8、 7.5.1 多重 PCR 扩增体系 产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25L反应体系:10 Buffer2.5L、50mmol/L MgCl 2 1.2L、10mmol/L dNTP 0.6L、Taq DNA聚合酶2U、10mol/L引物(扩增 组合)各1.0L、待测个体模板DNA (或者阳性对照 DNA)100ng、加双蒸水至反应总体积为25L。PCR扩 增时设计阴性对照(双蒸水作为模板)。 7.5.2 PCR 扩增条件 94预变性5min;94变性30s,5760.5 退火30s,72延伸30 s,35个循环;72延伸5min, 4保存。 7.6 P
9、CR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 7.6.1 先用水清洗制胶板,再用 1TAE 冲洗一次,水平放置。 7.6.2 根据电泳胶板的规格和检测样品的数量,配制 1%的琼脂糖溶液,在微波炉中加热融化至溶液澄 清透明,室温下冷却至 60左右时,加入溴化乙锭并混匀,使 EB 的终浓度为 0.5g/mL。 7.6.3 将混合液缓慢倒入制胶板中,排除气泡,插入多齿梳子。待凝胶凝固后,拔出梳子,将凝胶转 移至水平电泳槽中,往电泳槽中加入 1TAE 缓冲液,使电泳缓冲液没过胶面。 7.6.4 将待检 PCR产物 5 L 和上样缓冲液(6DNA Loading Buffer)以 5:1 的比例混合均匀,加入 点样孔;
10、同时选择点样孔点上 5 L 2000bp DNA Marker 作参照。恒压 100V,电泳 30min。电泳结束后 于凝胶成像系统观察,并分析记录。 7.7 微卫星 DNA多态性分析 DB37/ T 20312012 4 PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按 0.5 L:lOL:O.5L比例混合,95变性5min,ABI PRISM 3100仪器测序,ABI PRISM 3100 DATA COLLECTION软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TAMR A分别表 示蓝色、绿色和黑色。 8 结果判定 8.1 多重 PCR 产物检测 若4个PCR管均出现清晰条带,表明产物扩增成功,可
11、以进行测序。 图1 多重 PCR 产物 2%琼脂糖凝胶电泳图 注: 1- TGLA53、INRA023位点两重PCR产物;2- TGLA227、TGLA122、BM1818位点三重PCR产物;3 - BM2113、ETH225、 ILSTS006位点三重PCR产物;CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115位点四重PCR产物;M:DL 500 DNA Marker。 8.2 微卫星标记分型 利用ABI3100仪器对微卫星标记进行基因分型。 检测个体的12个微卫星标记的基因分型结果如附录D 所示,根据相对荧光强度和片段大小,可获得 待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体,
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