GB T 27642-2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法.pdf

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1、ICS 65.020.30 B 43 中华人民主t-、道B和国国家标准GB/T 27642一2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法Bovine individual and parental identification using microsatellite DNA 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-04-01实施发布GB/T 27642-2011 目次前言.皿1 范围2 规范性引用文件.3 术语、定义和缩略语4 原理25 防污染措施.26 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤.2 附录A(资料性附录)试剂配制及仪器.4 附录B(

2、资料性附录)DNA样品的制备附录C(资料性附录)光谱校正和PCR反应、测定及分析附录D(资料性附录)FAO-ISAG推荐的牛微卫星DNA标记10附录E(资料性附录)个体及亲子鉴定计算方法前言本标准按照GB/T1. 1-2009的规则进行起草。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位z全国畜牧总站。本标准主要起草人:刘丑生、王志刚、孙飞舟、邱小田、韩旭、于福清、张桂香。GB/T 27642-2011 m山牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法1 范围本标准规定了利用微卫星DNA标记进行牛个体及亲子鉴定的技术规程。本标准适用于普通牛(Bostaurus)个体和亲子鉴定。

3、2 规范性引用文件GB/T 27642-2011 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T 383 法庭科学DNA实验室检验规范SN/T 1193 基因检验实验室技术要求3 术语、定义和缩暗语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3. 1 聚合酶链式反应polymerase chain reaction , PCR 以一对寡核昔酸引物、四种脱氧核糖核昔酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2 微卫星

4、DNAmicrosatellite DNA 亦称短串联重复序列或简单重复序列(shorttandem repeats , STRs; simple sequence repeats , SSRs) ，以1bp6坤的短核昔酸序列为基本单位，呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。3.3 非父排除概率probability of paternity exclusion , PE 通过检测某一个遗传标记，能将不是生父的争议父亲排除的概率。3.4 累积非父排除概率cumulative probability of patemity exclusion , CPE 通过检测某一遗传标记系统的多个遗传标记，

5、将不是生父的个体否定掉的累计概率。3.5 亲权指数paternity index , PI 争议父亲提供生父等位基因成为子代生父的概率与随机公畜提供生父基因成为子代生父概率的比值。3.6 3. 7 累积亲权指数cumulative patemity index , CPI 根据某一遗传标记系统中的多个标记，计算多个亲权指数的累积。父子关系相对概率relative chance of paternity, RCP 争议父亲是亲生父亲的相对概率。GB/T 27642-2011 4 原理4. 1 个体鉴定原理某一被检样品与真样品微卫星标记的基因型不同，则判定被检样品与真样品来自不同个体，如果相同不排

6、除它们来自同一个体，通过对某一遗传标记系统的多个标记所检测，可在一定概率水平上判定被测样品与真样品是否来自同一个体。4.2 亲子鉴定原理根据孟德尔遗传分离定律，在配子细胞形成时，成对的等位基因彼此分离，随机进入配子细胞。双亲的配子细胞结合形成合子，其发育出来的子代的成对等位基因分别来自父亲和母亲。根据多个标记计算的鉴定结果在一定概率水平上可以判定争议父亲(母亲)是否为亲生父亲(母亲)(变异情况除外)。5 防污染措施按SN/T1193和GA/T383规定的方法执行。6 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤6. 1 样品制备收集血液、组朗(耳、肌肉、尾、皮肤等)、毛囊或精液等材料。6.2 样晶DNA的制备各

7、样品试剂配方、所需的仪器设备参见附录A，具体步骤参见附录B。6.3 光谱校正在实验前进行一次四色荧光素的光谱校正，目的为了校准信号重叠。具体步骤参见C.l。6.4 微卫星DNA标记参见附录D。6.5 PCR反应6.5.1 PCR反应体系参见表C.lo6.5.2 PCR反应程序参见表C.206.5.3 PCR产物电泳检测取适量PCR产物，上样于1%3%的琼脂糖凝肢中进行电泳，检测本次扩增反应是否成功。2 GB/T 27642-2011 6.6 测定及分析通过分析得到微卫星标记的基因型频率。参见C.3.6.7 利用微卫星DNA法进行个体鉴定的概率计算和结果表述被检样品的基因型与真样品不同，可排除两

8、份样品来源于同一个体(变异情况除外)。如果两份样品的基因型相同时，则按式(1)计算偶合概率，当其值小于该个体所在群体数量的倒数时(5XI0-9)，认定两份样品来源于同一个体。偶合概率是一组微卫星标记基因型频率的乘积。PM = P1 X P2 X P3 X X P. ( 1 ) 式中zPM 偶合概率;P 第i个微卫星标记的基因型频率。6.8 利用微卫星DNA法进行亲子鉴定认定和排除依据累积非父排除率注99.73%、父子关系相对概率二三99.95%或累积亲权指数二三2000，判定争议父亲为生父;累积非父排除率低于99.73%并且有3个以上标记不符合孟德尔遗传分离规律时，排除亲缘关系;如果累积非父排

9、除率低于99.73%并且有3个以下的作为不符合孟德尔遗传分离规律时，应适当增加检测的标记数量。具体计算公式参见附录E。3 GB/T 27642-20门A.1 试剂配制A. 1. 1 血液裂解液见表A.l。贮存液浓度1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0) 0.5 mol/L EDT A(pH8. 0) 10% SDS 灭菌双蒸水加至附录A(资料性附录)试剂配制及仪器表A.1血班裂解波体积mL 1 20 20 100 A. 1.2 组织DNA及毛囊提取液见表A.20表A.2组织DNA提取液贮存液浓度体积mL 1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0) 5 0.5 mol/L EDT

10、A(pH8.的20 0.5 mol/L NaCl 20 10% SDS 20 灭菌双蒸水加至100 A. 1.3 精子裂解液见表A.3。表A.3精子裂解液贮存液浓度体积mL 1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0) 1 0.5 mol/L EDTACpH8. 0) 2 o. 5 mol/L NaCl 20 10% SDS 20 1 mol/L DTT(现用现加0.0039 灭菌双蒸水加至100 4 使用浓度10 mmol/L 100 mmol/L 2% 使用浓度50 mmol/L 100 mmol/L 100 mmol/L 2% 使用浓度10 mmol/L 10 mmol/L 100

11、mmol/L 2% 39mol/L GB/T 27642-2011 A. 1.4 精子洗涤液取1mol/L的NaCl37.5 mL, O. 5 mol/L的EDTA5 mL，加双蒸水至250mLo高压灭菌备用。A. 1.5 蛋白酶K贮存液(20mg/mL) 200 mg蛋白酶K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL，一200C冻存。A. 1.6 TE缓冲液(pH8.0)10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0) ,1 mmol/L EDTA(pH8. 0)。A. 1.7 电泳缓冲液1XTris-乙酸(TAE): O. 04 mol/L Tris-乙酸，0.01mol/L EDT

12、Ao O. 5X Tris-棚酸(TBE):0. 045 mol/L Tris-跚酸，0.01mol/L EDT A。A. 1. 8 澳化乙链溶液(EB，10mg/mL) 用少量双蒸水溶解1g澳化乙链，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，定容至100mL，然后转移到棕色瓶或铝韬包裹容器中，室温保存。A. 1. 9 6X上样缓冲液0.05%澳酣蓝，0.12%二甲苯青FF，40%(质量浓度)蔚糖水溶液z或0.05%澳酣蓝，0.12%二甲苯青FF，30%(体积分数)甘油水溶液。A. 1. 10 1 mol/L二硫苏糖酶(DTT)用20mL 0.01 mol/L乙酸铀溶液(pH5.2)溶解3.09g DT

13、T，过滤除菌后分装成1mL贮存于一200C。注意:DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。A. 1. 11 1 mol/L Tris(pH8. 0) 将121.1 gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH值至8.0，定容至1000mL后高压灭菌。A. 1. 12 O. 5 mol/L EDT A(pH8. 0) 将186.1g Na2EDTA. 2H20，加入800mL水中，再加入NaOH(约20g)调pH值至8.0，定容后高压灭菌。A. 1. 13 10%SDS (500 mL) 将50gSDS加入400mL水中，60.C加热溶解，定容后过滤灭菌。A. 1. 14 Tris饱和酣。A.

14、 1. 15 酣z三氯甲烧=异戊醇(25: 24 : 1)混合液。A. 1. 16 三氯甲烧z异戊醇(24: 1)混合液。A.2 仪器A.2.1 遗传分析仪。A.2.2 PCR仪。A.2.3 低温高速离心机。A.2.4 生物分光光度计。A.2.5 稳压稳流电泳仪。A.2.6 八道电子可调移液器(量程5L100L)。A.2.7 八道电子可调移液器(量程0.2L10L)。A.2.8 单道可调移液器(2L，10L，200L，1000L)。A.2.9 电子天平(量程0.01mg 300 mg)。A. 2.10 水浴恒温震荡器。A. 2.11 普通离心机。A. 2.12 紫外光检测仪。A. 2.13 超

15、声波清洗器。A. 2.14 超纯水器。A. 2.15 高压灭菌器。5 GB/T 27642-2011 B.1 样晶预处理B. 1. 1 从血波中提取基因组DNA附录B(资料性附录)DNA样晶的制备B. 1. 1. 1 取适量血液加入等体积血样裂解液，加入RNA酶至终浓度为20问/mL，充分混匀，于37.C水浴消化1h2h。B. 1. 1.2 加入蛋白酶K贮存液至终浓度为100g/mL，充分混匀，55.C水浴消化12h以上至不见粘稠的团块。B. 1.2 从组织中提取基因组DNAB. 1. 2. 1 取0.3g的组织置于1.5 mL离心管中，将其破碎。B. 1.2.2 晾干后加入500L组织DNA

16、提取液，然后加入RNA酶至终浓度为20g/mL，充分混匀，37.C水浴消化1ho B. 1. 2. 3 加蛋白酶K贮存液至终浓度为150g/mL200g/mL，充分混匀，55.C7l浴消化12h以上至不见有组织块。B. 1.3 从毛囊中提取基因组DNAB. 1. 3. 1 用灭菌双蒸水洗涤毛囊，剪碎，置于小离心管中。B. 1. 3. 2 晾干后加入30L50L组织DNA提取液，然后加入蛋白酶K至终浓度为200g/mL，充分混匀，55.C水浴消化12h以上至毛囊完全溶解。B. 1.4 从精液中提取基因组DNAB. 1. 4. 1 每一个体取冻精三粒或鲜精0.4mL，置于1.5 mL离心管中。B.

17、 1.4.2 加等量精子洗涤液，4500r/min离心6min，弃上清液。B. 1. 4. 3 重复洗涤精子沉淀两次，去掉其中的卵黄甘油等物质。B. 1. 4. 4 用0.4mL精子裂解液重悬沉淀。B. 1. 4. 5 加入蛋白酶K贮存液至终浓度为100g/mL，充分混匀，55.C水浴消化过夜至少12h。B.2 样品抽提B. 2.1 加入等体积Tris饱和酣，反复颠倒离心管，使两相溶液充分混合形成乳浊液，4.C 4500 r/min 离心15min;小心吸取上清液转移至另一洁净的离心管中;重复该操作一次。B.2.2 加入等体积的酣z三氯甲烧=异戊醇(25: 24 : 1)混合液，缓慢颠倒离心管

18、，使两相溶液充分混合，4.C 4500 r/min离心15min。B. 2. 3 加入等体积三氯甲皖:异戊醇(24: 1)混合液，缓慢颠倒离心管，使两相溶液充分混合，4.C4500 r/min离心15min;收集上清至另一离JL管中。B.2.4 将上清液吸至较大容量的试管中，加人1/10体积3mol/L NaAc溶液(pH5.2)和2.5倍体积的GB/T 27642-2011 预冷无水乙晖，轻轻摇动试管至出现白色絮状DNA沉淀。B.2.5 将DNA沉淀转移到1.5 mL离心管中，用75%乙醇洗涤两次。B.2.6 将DNA干燥后加入造量TE缓冲液或灭菌双蒸水室温溶解24ho B.3 样晶基因组D

19、NA浓度检测吸出适量提取的DNA，稀释50倍，用生物分光光度仪检测DNA的浓度，根据测定结果再将DNA溶液稀释至预定值。较纯DNA样品的AZ60/Az60比值为1.8左右F若该比值大大低于1.8，说明样品中含有较多的蛋白质，应进一步纯化。H = AZ60 X N X 50 式中zH一-DNA浓度，单位为微克每毫升(g/mL); N一一稀释倍数。对于双链DNA来说.10D=50g/mL。B.4 样晶基因组DNA纯度和质量检测.( B.l ) 吸出适量提取的DNA，在琼脂糖凝肢中进行电泳，然后在紫外透视仪下检测DNA质量，如果DNA条带比较整齐、亮度较高，DNA样品的A260/A60比值为1.8左

20、右，则说明提取的DNA样品可以用于牛个体及亲子鉴定。7 GB/T 27642-2011 附录C(资料性附录光谱校正和PCR反应、测定及分析C. 1 光谱校正的具体步骤C. 1. 1 将标准品中的4支离心管充分混合离心。C. 1.2 从4管中各取混合好的标准标记品(内含5FAM，JOE，NED，ROX)1.25L，再力日195L的高纯度甲酷胶转移至另一1.5 mL的离心管中。C. 1.3 充分混匀离心。C. 1.4 95 c变性5min,4 c保存10min. C. 1.5 取10L变性产物加到96孔上样板上，把96孔上样板放到遗传分析仪中。C. 1.6 毛细管电泳参考条件:一一毛细管z长度36

21、cm，内壁元涂层z推荐炉温:60.C。C. 1.7 如果校正结果能够达到仪器所要求的参数范围，则预实验通过。标准品测试结果要求Q值0.95，C值在48.5之间。C.2 PCR反应体系及反应程序表C.lPCR反应体系组分单倍反应体系L PCR Buffer 0.5 dNTPs(lO mmol/L) 1. 2 AmpliTaq Gold DNA聚合酶(2.5UjL) 0.1 11对引物的混合物1. 7 去离子水0.5 样品基因组DNA1. 0 总体积5.0 表C.2PCR反应程序35个-40个循环预变性最后延伸加尾保存变性退火延伸95 c 94 c 55 .C-63 c 72.C 72 C 25.

22、C 4 C 15 min 45 s 45 s 60 s 60 min 2h 8 GB/T 27642-2011 C.3 测定及分析C. 3.1 测定将PCR产物稀释15倍，从中取1L与11.5L甲酷胶和0.25L分子量内标混合.95.C变性2 min5 min.立即放4.C10 min。C.3.2 分析以样品峰长度值和分子量内标的峰长度值比较定量。得到各标记的等位基因片段大小，计算基因型频率。9 GB/T 27642-2011 附录D(资料性附录)FAO-ISAG推荐的牛微卫星DNA标记表D.1 FAO-ISAG推荐的牛微卫星DNA标记标记退火温度等位基因序号名称染色体引物序列(上下游序列均为

23、53) 范围bp INRA063 ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC 1 18 55-58 167-189 (Dl8S5) AAACCACAGAAATGCTTGGAAG INRA005 CAATCTGCATGAAGTATAAATAT 2 12 55 135-149 (Dl2S4) CTTCAGGCATACCCTACACC ETH225 GATCACCTTGCCACTATTTCCT 3 9 55-65 131-159 (D9S1) ACATGACAGCCAGCTGCTACT ILSTS005 GGAAGCAATGAAATCTATAGCC 4 10 54-58 176-194 (DlO

24、S25) TGTTCTGTGAGTTTGTAAGC HEL5 GCAGGATCACTTGTTAGGGA 5 21 52-57 145-171 (D21S15) AGACGTTAGTGTACATTAAC HELl CAACAGCTATTTAACAAGGA 6 15 54-57 99-119 (Dl5S10) AGGCTACAGTCCATGGGATT INRA035 ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG 7 16 55-60 100-124 (Dl6S1 1) TTGTGCTTTATGACACTATCCG ETH152 TACTCGTAGGGCAGGCTGCCTG 8 5 55-60 18

25、1-211 (D5S1) GAGACCTCAGGGTTGGTGATCAG INRA023 GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC 9 3 55 195-225 (D3S10) TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC ETH10 GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA 10 5 55-65 207-231 (D5S3) CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC HEL9 CCCATTCAGTCTTCAGAGGT 11 8 52-57 141-173 (D8S4) CACATCCATGTTCTCACCAC CSSM66 ACACAAATCCTTTCTGCCAGC

26、TGA 12 14 55-65 171-7, 09 (Dl4S3 1) AATTT AATGCACTGAGGAGC TGG INRA032 AAACTGTATTCTCTAATAGCTAC 13 11 55-58 160-204 (Dl1S9) GCAAGACATATCTCCATTCCTTT ETH3 GAACCTGCCTCTCCTGCATTGG 14 19 55-65 103-133 (Dl9S2) ACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGG BM2113 GCTGCCTTCTACCAAATACCC 122-156 I 15 2 55-60 (D2S26) CTTCCTGAGAGAAGCAA

27、CACC BM1824 GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC 16 1 55-60 176-197 (DlS34) CATTCTCCAACTGCTTCCTTG 10 GB/T 27642-2011 表D.l(续)标记退火温度等位基因序号染色体引物序列(上下游序列均为5一叶)范围名称 bp HEL1 3 TAAGGACTTGAGATAAGGAG 17 11 52-57 178-200 (D11S15) CCATCTACCTCCATCTTAAC INRA037 GATCCTGCTTATATTTAACCAC 18 10 57-58 112-148 (D10S12) AAAATTCCATGGAG

28、AGAGAAAC BM1818 AGCTGGGAATATAACCAAAGG 19 23 56-60 248-278 (D23S2 1) AGTGCTTTCAAGGTCCATGC ILSTS006 TGTCTGTATTTCTGCTGTGG 20 7 55 277-309 (D7S8) ACACGGAAGCGATCTAAACG MM12 CAAGACAGGTGTTTCAATCT 21 9 50-55 101-145 (D9S20) ATCGACTCTGGGGATGATGT CSRM60 AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA 22 10 55-65 79-115 (D10S5) AGGA

29、CCAGATCGTGAAAGGCATAG ETH185 TGCATGGACAGAGCAGCCTGGC 23 17 58-67 214-246 (D17Sl) GCACCCCAACGAAAGCTCCCAG HAUT24 CTCTCTGCCTTTGTCCCTGT 24 22 52-55 104-158 (D22S26) AATACACTTTAGGAGAAAAATA HAUT27 TTTTATGTTCATTTTTTGACTGG 25 26 57 120-158 (D26S21) AACTGCTGAAATCTCCATCTTA TGLA227 CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT 26 1

30、8 55-56 75-105 (D18Sl) ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA TGLA126 CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT 27 20 55-58 115-131 (D20Sl) TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC TGLA122 CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC 28 21 55-58 136-184 (D21S6) AATCACATGGCAAATAAGTACATAC TGLA53 GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA 29 16 55 143-191 (D16S3) ATCTTCACATGATATTACAGCAG

31、A SPS115 AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG 30 15 55-60 234-258 (D15) AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG TTCCTCTGAGTCTCTGACAC 31 MCM158 Y 56-60 112-148 CCGAGATTGAAATGTAAATGAG ATTGACACTTCAGTAAGTTA 32 MAF45 Y 55-58 122-142 CAGACACAACTGAGCAACTAGC GATCCATCCACATTGCTCCA 33 UMN0108 Y 58-67 158-209 CCAAGCGTCCATCAATTTAC ACCAGCT

32、GATACACAAGTGC 34 UMN0929 Y 55-58 174-196 GGTCAGAGAATGAAACAGAG 11 GB/T 27642-2011 附录(资料性附录)个体及亲子鉴定计算方法E 个体、母亲和假定父亲的基因型均已知的情况根据单个微卫星DNA标记计算的非父排除概率公式见式(E.l): PEk二1-2到+艺Pt+ 2 Pt - 3 P - 2 ( P ) 2 + 3 (p) (2: Pt ) E. 1 E. 1. 1 . ( E.1 ) 式中zPEk一一第h个微卫星DNA标记的非父排除概率;一一一第h个微卫星DNA标记第i个等位基因的频率;一一标记数。根据是个微卫星DNA

33、标记计算的累积非父排除概率的公式见式(E.2): CPE =1一(1- PE 1 ) (1 - PE 2) (1 - PE 3 )(1- PEk) Pi n E. 1.2 、，nL E r飞式中zCPE一一累积非父排除概率;PEk一一一第h个微卫星DNA标记的非父排除概率。个体和一亲本的基因型已知，而另一亲本基因型未知的情况PE k = 1 - 4 2: P + 2 (艺的2十42:Pt- 3 Pt CPE =1一(1- PE 1 ) (1 - PE 2)( 1 - PE 3 )(1- PEk) ( E.4 ) 飞/叫uE ，.、E.2 PEk、Pi和CPE同E.L两个亲本的基因型均未知的情况

34、hr n艺叫+ hr n2H nZH 。+ ba n2凶。ohr n2H nUhr n艺4 hr n2 4 + 一-E P E. 3 、BJF气un ，、，/nhv E ，、CPE=l一(1- PE 1 ) ( 1 - PE 2) (1 - PE 3 )(1- PEk) PEk、Pi和CPE同E.L.( E.7 ) 亲权指数(PI)和累计亲权指数(CPI)PI =P,jPj CPI =Plj X PI2 X Plk E. 4 .( E.8 ) 一一亲权指数;式中zPI 12 Pi 一一争议父亲提供生父基因的概率FR 一一该基因在群体中的随机频率;CPI一一累计亲权指数;Plk一一第h个标记的亲

35、权指数。E.5 父子关系相对机会GB/T 27642-2011 RCP =CPI/CCPI + 1) x 100% C E.9 ) 式中zRCP一一父子关系相对概率;CPI一一累计亲权指数。FFON|N寸hNH阁。华人民共和国家标准牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法GB/T 27642-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数24千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版* 书号:155066 1-44341 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27642-2011 打印H期:2012年4月16HF002A