DB15 T 1848—2020 动物垫料中沙门氏菌检测.pdf

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1、ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1848 2020 动物垫料中沙门氏菌检测 Detection for salmonella in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1848 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人：赵治国、崔强、王海艳、

2、于志超、陈林军、延涵、任彩霞、潘国卿、姚利宏、 陈少博、罗晓平、李军燕。 DB15/T 1848 2020 1 动物垫料中沙门氏菌检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中沙门氏菌的分离鉴定定性检测法。 本标准适用于动物垫料中沙门氏菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T

3、 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫 物。 4 设备和材料 4.1 冰箱： 2 5 。 4.2 恒温培养箱： 36 1 ， 42 1 。 4.3 均质器。 4.4 漩涡振荡器。 4.5 电子天平：感量 0.1 g， 0.0001 g 4.6 全自动微生物生化鉴定系统。 4.7 飞行时间质谱仪。 4

4、.8 二级生物安全柜。 4.9 pH 计。 4.10 微量移液器。 4.11 无菌锥形瓶：容量 500 mL， 250 mL。 DB15/T 1848 2020 2 4.12 无菌吸管： 1 mL(具 0.01 mL刻度 )、 10 mL(具 0.1 mL刻度 )或微量移液器及吸头。 4.13 无菌培养皿： 15 mm 90 mm。 4.14 无菌试管： 18 mm 180 mm。 4.15 无菌棉签。 4.16 无菌镊子。 4.17 无菌剪刀。 4.18 无菌勺。 4.19 无菌玻片。 4.20 无菌接种环。 5 培养基和试剂 5.1 实验用水：符合 GB/T 6682的要求 。 5.2 缓

5、冲蛋白胨水 (BPW)：见附录 A.2。 5.3 MkTTn肉汤：见附录 A.3。 5.4 亚硒酸盐胱氨酸 (SC)增菌液：见附录 A.4。 5.5 亚硫酸铋 (BS)琼脂：见附录 A.5。 5.6 HE琼脂：见附录 A.6。 5.7 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)琼脂：见附录 A.7。 5.5 沙门氏菌属显色培养基。 5.9 三糖铁 (TSI)琼脂：见附录 A.8。 5.10 蛋白胨水、靛基质试剂：见 附录 A.9。 5.11 尿素琼脂 (pH7.2)：见附录 A.10。 5.12 氰化钾 (KCN)培养基：见附录 A.11。 5.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见 附录 A.12。 5.14

6、 糖发酵管：见附录 A.13。 5.15 邻硝基酚 -D半乳糖苷 (ONPG)培养基：见附录 A.14。 5.16 半固体琼脂：见 附录 A.15。 5.17 丙二酸钠培养基：见附录 A.16。 5.18 无菌生理盐水：见附录 A.17。 5.19 生化鉴定试剂盒。 5.20 革兰氏染液。 5.21 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 5.22 飞行质谱仪靶板。 5.23 沙门氏菌标准菌株 ATCC 13311或等效菌株。 5.24 大肠杆菌标准菌株 CMCC 44102或等效菌株。 5.25 产气肠杆菌标准菌株 ATCC 13048或等效菌株。 6 检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1。 DB15/T

7、1848 2020 3 36 1 ， 16 h 20 h 36 1 ， 24 h 2 h 36 1， 18 h 24 h 36 1 ， 40 h 48 h 36 1 ， 18 h 24 h 图 1 沙门氏菌检验程序 7 操作步骤 7.1 采样 样品制备 检样 25g 或 25cm2样液 +225mL BPW 预增菌 1mL+10mL MkTTn 1mL+10mL SC BS 琼脂平板 XLD（或 HE、显色培养基） 挑取纯培养后的可疑菌落 生化鉴定和 /或全自动检测设备鉴定 沙门氏菌 非沙门氏菌 血清学鉴定 报 告 DB15/T 1848 2020 4 7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机

8、性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少 250 g，充分混匀后称取 25 g 颗粒状或粉 末状垫料样品，加入 225 mL BPW，充分振摇或均质 1 min 2 min，置 36 1 培养 16 h 20 h， 进行预增菌。 7.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（ 5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 m

9、L 无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积 大小 重复取样 1 4 个规格板面积，相应地将棉拭子头置入 25 mL 100 mL 的无菌稀释液中，充分振摇制成 样品原液（ 1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2）。取 25 mL 样品原液加入 225 mL BPW，充分振摇或均质 1 min 2 min，置 36 1 培养 16 h 20 h 进行预增菌。 表 1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于 0.25（含） 25 1 0.25 0.5（含） 50 2 0.5 0.75（含） 75 3 大于 0.75 100 4 7.2 选择 性 增菌 轻轻

10、摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL 转种于 10 mL MkTTn 肉汤内，于 36 1 培养 24 h 2 h。同时，另取 1 mL 转种于 10 mL SC 增菌液中，于 36 1 培养 18 h 24 h。 7.3 分离培养 用直径 3 mm的接种环取 MkTTn 肉汤和 SC 增菌液各 1环，分别划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板 (或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板 )，于 36 1 培养 40 h 48 h(BS 琼 脂平板 )或 18 h 24 h(XLD 琼脂平板、 HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板 )，观察各个平板上生 长的菌落，根据菌

11、落形态初步判定典型和可疑菌落，沙门氏菌在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表 2。 根据菌落 形态挑 取 5个 典型或 可疑 菌落（ 少于 5个时 ，全部挑取） ，分别 划线接种于营养琼脂平皿 进 行 分离 纯化 ， 36 1 培养 18 h 24 h。 DB15/T 1848 2020 5 表 2 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌菌落形态 BS琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基无变化。 HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD

12、琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 依据显色培养基的说明书判定。 7.4 鉴定 7.4.1 染色 镜检 沙门氏菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞 ,一般无荚膜，直径约为 0.6 m 1 m。 7.4.2 生化 鉴定 挑取纯培养的菌落进行沙门氏菌生化鉴定，具体操作依据沙门氏菌生化鉴定试剂说明书或见附录 B。 7.4.3 辅助 设备鉴定 可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等对典型或可疑菌落进行鉴 定，具体操作依据标准 GB/T 33682 和设备操作规范进

13、行。 7.4.4 血清学 鉴定 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阳性的菌株，进行血清学鉴定。 7.4.4.1 自凝性检查 先在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，挑取适当大小的纯菌落（用于纯培养的营养琼脂琼脂含量为 1.2 % 1.5 %）混合于生理盐水滴内，使其成为均一的混浊悬液（轻度乳浊），将玻片轻轻摇动 1 min 2 min，在黑色背景下观察反应，若出现可见白色的菌体凝集块，即为有自凝性，反之为无自凝性。对 无自凝性的培养物进一步进行血清学鉴定。 7.4.4.2 多价菌体抗原 (O)鉴定 用 O 抗原进行鉴定，具体操作同 7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

14、 O 血清不凝集时， 将菌株接种在琼脂量较高的（如 2 % 3 %）培养基 上培养后再鉴定；如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O抗原凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL生理盐水中制成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再鉴定。 7.4.4.3 多价鞭毛抗原 (H)鉴定 操作同 7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55 % 0.65 %半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，取其边缘菌进行鉴定。 DB15/T 1848 2020 6 7.4.4.4 表面 抗原（ Vi） 鉴定 用 Vi 抗原进行鉴定，具体操作同 7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳

15、性反应。已知具有 Vi 抗 原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。 8 结果与报告 8.1 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阳性的菌株，同时血清学鉴定结果 为阳性，报告动物垫料样品中检出沙门氏菌。 8.2 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阴性的菌株，报告动物垫料样品中 未检出沙门氏菌。 9 生物安全措施 为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照 GB 19489的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理 至少 30 min后再弃置

16、。 DB15/T 1848 2020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照 SN/T 1538.1和 SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 缓冲蛋白胨水 (BPW) A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 (含 12个结晶水 ) 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH至 7.2 0.2，高压灭菌 121

17、 ， 15 min。 A.3 MkTTn肉汤 A.3.1 基础液 酪胨 8.6 g 牛肉粉 4.3 g 氯化钠 2.6 g 硫代硫酸钠 30.5 g 碳酸钙 38.7 g 牛胆盐 4.78 g 煌绿 0.0096 g 新生霉素 0.04 g 蒸馏水 1000 mL 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH至 8.2 0.2，摇匀煮沸灭 菌。 DB15/T 1848 2020 8 A.3.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠 (含 5个结晶水 ) 50.0 g 蒸馏水 加至 100 mL 高压灭菌 121 ， 20 min。 A.3.3 0.5 %煌绿水溶液 煌绿 0.5

18、g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存放暗处，不少于 1 d，使其自然灭菌。 A.3.4 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮沸至完全溶解， 121 高压灭菌 20 min。 A.3.5 制法 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种 成分。 A.4 亚硒酸盐胱氨酸 (SC)增菌液 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L-胱氨酸 0.01 g 蒸馏水

19、1000 mL A.4.2 制法 除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55 以下，以无菌操作加 入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液 10mL(称取 0.1 g L-胱氨酸，加 1 mol/L氢氧化钠溶液 15 mL，溶解， 再加无菌蒸馏水至 100 mL即成，如为 DL-胱氨酸，用量应加倍 )。摇匀，调节 pH至 7.0 0.2。 A.5 亚硫酸铋 (BS)琼脂 DB15/T 1848 2020 9 A.5.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉 膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 硫酸亚铁 0.3 g 磷酸氢二钠 4.0 g 煌绿 0.025 g或 5.

20、0 g/L水溶液 5.0 mL 柠檬酸铋铵 2.0 g 亚硫酸钠 6.0 g 琼脂 18.0 g 20.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.2 制法 将前三种成分加入 300 mL蒸馏水 (制作基础液 )，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL和 30 mL蒸馏 水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL和 30 mL蒸馏水中，琼脂加入 600 mL蒸馏水中；然后分 别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。 将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH至 7.5 0.2，随即倾入琼脂液中， 混合均匀，冷至 50

21、55 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h会降低 其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.6 HE 琼脂 (Hektoen Enteric Agar) A.6.1 成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2.0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 18.0 g 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 0.4 %溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mL Andrade指示剂 20.0 mL 甲液 20.0 mL 乙液 2

22、0.0 mL A.6.2 制法 将前面七种成分溶解于 400 mL蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于 600 mL蒸馏水内。然后分别搅拌 均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节 pH 至 7.5 0.2。再加入指示剂并与琼脂液合并， 待冷至 50 55 倾注平皿。 DB15/T 1848 2020 10 注 1： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。 注 2： 甲液的配制 硫代硫酸钠 34.0 g 柠檬酸铁铵 4.0 g 蒸馏水 100 mL 注 3： 乙液的配制 去氧胆酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 mL 注 4： Andrade 指示剂 酸性复红

23、0.5 g 1mol/L氢氧化钠溶液 16.0 mL 蒸馏水 100 mL 将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液 1 mL 2 mL。 A.7 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)琼脂 A.7.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1000 mL A.7.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH至 7.4

24、 0.2。另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 55 倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当 天制备，第二天使用。 A.8 三糖铁 (TSI)琼脂 DB15/T 1848 2020 11 A.8.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵 (含 6个结晶 水 ) 0.2 g 酚红 0.025 g或 5.0 g/L溶液 5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼脂

25、 12.0 g 蒸馏水 1000 mL A.8.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH至 7.4 0.2。另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂混匀，分装试管，每管约 2 mL 4 mL，高压灭菌 121 10 min或 115 15 min，灭菌后制成高层斜面，呈桔红色。 A.9 蛋白胨水、靛基质试剂 A.9.1 蛋白胨水 蛋白胨或胰蛋白胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000 mL 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH至 7.4 0.2，分装小试管， 121 高压灭菌 15 m

26、in。 A.9.2 靛基质试剂 A.9.2.1 柯凡克试剂 将 5 g对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.9.2.2 欧 -波试剂 将 1 g对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL 95 % 乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。 A.9.3 试验方法 挑取小量培养物接种，在 36 1 培养 1 d 2 d，必要时可培养 4 d 5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧 -波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养 液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注： 蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应

27、先用已知菌种鉴定后方可使用。 DB15/T 1848 2020 12 A.10 尿素琼脂 (pH7.2) A.10.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4 %酚红 3.0 mL 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 20 %尿素溶液 100 mL A.10.2 制法 除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入 400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH至 7.2 0.2。另将琼 脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装， 121 高压灭菌 15 min。冷至 50 55 ，加 入经除菌过滤

28、的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2 %。分装于无菌试管内，放成斜面备用。 A.10.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种，在 36 1 培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变 为红色。 A.11 氰化钾 (KCN)培养基 A.11.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1000 mL 0.5 %氰化钾 20.0 mL A.11.2 制法 将除氰化钾以外的成分加入 蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 高压灭菌 15 min。放在冰箱内使其 充分冷却。每 100 mL培养基加入 0.5 %氰化钾溶液 2.0

29、mL(最后浓度为 1:10000)，分装于无菌试管内，每 管约 4 mL立刻用无菌橡皮塞塞紧，放在 4 冰箱内，至少可保存两个月。同时将不加氰化钾的培养基作 为对照培养基，分装试管备用。 A.11.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1环接种于氰化钾 (KCN)培养基。并另挑取 1环 接种于对照培养基。在 36 1 培养 1 d 2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性 (不抑制 )，经 2 d 细菌不生长为阴性 (抑制 )。 DB15/T 1848 2020 13 注： 氰化钾是剧毒药，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原

30、因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应， 试验时对每一环节都要特别注意。 A.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.12.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1000 mL 1.6%溴甲酚紫 -乙醇溶液 1.0 mL L-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL或 1.0 g/100 mL A.12.2 制法 除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。 L-赖氨酸按 0.5 %加入 DL- 赖氨酸按 1 %加入。调节 pH 至 6.8 0.2，对照培养基不加赖氨

31、酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL， 上面滴加一层液体石蜡， 115 高压灭菌 10 min。 A.12.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 1 培养 18 h 24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者 由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变 为黄色。对照管应为黄 色。 A.13 糖发酵管 A.13.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠 (含 12个结晶水 ) 2.0 g 0.2 %溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1000 mL A.13.2 制法 A.13.2.1 葡萄糖发酵管按上

32、述成分配好后，调节 pH至 7.4 0.2。按 0.5 %加入葡萄糖，分装于有一个 倒置小管的小试管内， 121 高压灭菌 15 min。 A.13.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL， 121 高压灭菌 15 min。另将各 种糖类分别配好 10 %溶液，同时高压灭菌。将 5 mL糖溶液加入于 100 mL培养基内，以无菌操作分装小试 管。 注： 蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 DB15/T 1848 2020 14 A.13.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 1 培养，一般 2 d 3 d。迟缓反应需观察 14 d 3

33、0 d。 A.14 邻硝基酚 -D 半乳糖苷 (ONPG)培养基 A.14.1 成分 邻硝基酚 -D半乳糖苷 (ONPG) 60.0 mg 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液 (pH7.5) 10.0 mL 1 %蛋白胨水 (pH 7.5) 30.0 mL A.14.2 制法 将 ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，用橡 皮塞塞紧。 A.14.3 试验方法 自琼脂斜面上挑取培养物 1满环接种于 36 1 培养 1 h 3 h和 24 h观察结果。如果 -半乳糖 苷酶产生，则于 1 h 3 h变黄色，如无此酶则 24 h不变色。 A.15 半

34、固体琼脂 A.15.1 成分 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35 g 0.4 g 蒸馏水 100 mL A.15.2 制法 按以上成分配好，煮沸溶解，调节 pH 至 7.4 0.2。分装小试管 121 高压灭菌 15 min。直立凝固 备用。 注： 供动力观察、菌种保存、 H抗原位相变异试验等用。 A.16 丙二酸钠培养基 A.16.1 成分 酵母浸膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷酸二氢钾 0.4 g 氯化钠 2.0 g DB15/T 1848 2020 15 丙二酸钠 3.0 g 0.2 %溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL

35、 蒸馏水 1000 mL A.16.2 制法 除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH 至 6.8 0.2，再加入指示剂，分装试管 121 高压灭菌 15 min。 A.16.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于 36 1 培养 48 h，观察结果，阳性者由绿色变为蓝色。 A.17 无菌生理盐水 A.17.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.17.2 制法 氯化钠加入 1000 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解， 分装后， 121 灭菌 15 min，备用。 DB15/T 1848 2020 16 B B 附 录 B （规范性附录） 生化试验 自选择性琼脂平板上分别挑取 5

36、个以上典型或可疑菌落接种三糖铁琼脂，先在斜面划线再于底层穿 刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 1 培养 18 h 24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 B.1。 表 B.1 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三塘铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 K A +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属 A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 A A +/- +/- - 非沙门氏菌 K

37、K +/- +/- +/- 非沙门氏菌 注： K：产碱， A：产酸； +：阳性， -：阴性； +(-) ：多数阳性，少数阴性； +/-：阳性或阴性。 B.1.1 沙门氏菌属生化反应初步鉴别 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛 基质试验 )、尿素 琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 1 培养 18 h 24 h，必要时可延长至 48 h，按表 B.2判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 5 或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 表 B.2 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 序号 硫化氢 靛基质 pH7.2尿素 氰化钾 (KCN) 赖氨酸脱羧酶 A1 + -