DIN 10325-2010 Milk and milk products - Determination of the citric acid content - Enzymatic method《牛奶和奶制品 柠檬酸含量的测定 酵素法》.pdf

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1、Juli 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!$ak“16

2、27291www.din.deDDIN 10325Milch und Milcherzeugnisse Bestimmung des Citronensuregehaltes Enzymatisches VerfahrenMilk and milk products Determination of the citric acid content Enzymatic methodLait et produits laitieres Dtermination de la teneur en acide citrique Mthode enzymatiqueAlleinverkauf der No

3、rmen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10325:1986-01www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDIN 10325:2010-07 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Begriffe .4 4 Kurzbeschreibung .4 5 Chemikalien5 6 Gerte6 7 Probenahme .7 8 Durchfhrung.7 8.1 Vorbereitung

4、 der Probe.7 8.2 Herstellen der Probenlsungen von Milch, Kse, Schmelzkse und -zubereitungen und pulverfrmigen Milcherzeugnissen .8 8.3 Herstellen der Probenlsung von Butterplasma 9 8.4 Blindwert.9 8.5 Bestimmung .9 9 Auswertung 10 9.1 Berechnung10 9.2 Przision des Verfahrens11 10 Untersuchungsberich

5、t 11 Literaturhinweise 12 2 DIN 10325:2010-07 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeits-ausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet. nderungen Gegenber DIN 10325:1986-01 wurden fol

6、gende nderungen vorgenommen: a) Titel und Anwendungsbereich von Schmelzkse auf Milch und Milcherzeugnisse gendert; b) Ergebnisse eines Ringversuches an verschiedenen pulverfrmigen Milcherzeugnissen aufgenommen; c) Norm technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und damit an die derzeit gltige

7、n Gestaltungs-regeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10325: 1971-03, 1986-01 3 DIN 10325:2010-07 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung des Citronensure- bzw. Citratgehaltes in Milch und Milcherzeugnissen fest. Das Verfahren ist bei Milch, Kse, Schmelzkse und -

8、zubereitungen, pulverfrmigen Milcherzeugnissen und Butterplasma anwendbar. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte

9、Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Leitfaden zur Probenahme 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Citronensuregehalt nach dieser Norm bestimmter Gehalt an Citronensure bzw. Citrat

10、 ANMERKUNG Er wird in g je 100 g der Probe bzw. bei Butter in mg je 100 g der Probe angegeben. 4 Kurzbeschreibung In dem wssrigen Extrakt oder durch Fllung mit Trichloressigsure von Fett und Eiwei befreiten wssrigen Extrakt der Probe bzw. von mikrofilitriertem Butterplasma wird Citronensure durch da

11、s Enzym Citrat-Lyase (CL) zu Oxalessigsure und Essigsure gespalten. In Gegenwart der Enzyme L-Malat-Dehydrogenase (L-MDH) und L-Lactat-Dehdrogenase (L-LDH) werden Oxalessigsure und ihr mgliches Decarboxylierungs-produkt (Brenztraubensure) durch reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) zu L-

12、pfelsure bzw. L-Milchsure reduziert. Die Menge des bei diesen Reaktionen verbrauchten NADH wird durch Messung der Extinktionsabnahme in der Probenlsung bei 340 nm (Hg 334 nm, Hg 365 nm) bestimmt und ist der vorhandenen Citronensure bzw. Citraten proportional. Die in einer Kvette ablaufenden Reaktion

13、en laufen nach folgendem Reaktionsschema ab: Essigsure ureOxalessigs ureCitronensCL+ (1) 2CO ensureBrenztraub ureOxalessigs + (2+ NAD pfelsure-L H NADH ureOxalessigsMDH-L(3) + NAD Milchsure-L H NADH ensureBrenztraubLDH-L(4) 4 DIN 10325:2010-07 5 Chemikalien 5.1 Allgemeines Sofern nicht anders angege

14、ben, sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das fr die Probenlsung verwendete Wasser muss mindestens die Reinheit von destilliertem Wasser haben. Zur Herstellung der Enzymlsung und der Coenzymlsung ist frisch bidestilliertes Wasser zu verwenden. ANMERKUNG Die Reagenzien 5.5 bis 5.10 sind als T

15、estkombination im Handel erhltlich. 5.2 Trichloressigsurelsung, Massenkonzentration (CCl3COOH) = 200 g/l 200 g Trichloressigsure werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst, bis zur Marke aufgefllt und gemischt. 5.3 Natronlauge, Stoffmengenkonzentration c(NaOH) = 1 mol/l 40 g Natriumhydroxid

16、 werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst, bis zur Marke aufgefllt und gemischt. 5.4 Natronlauge, c(NaOH) = 0,1 mol/l 4 g Natriumhydroxid werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst, bis zur Marke aufgefllt und gemischt. 5.5 Glycylglycin (C4H8N2O3) 5.6 Zinkchloridlsung, (ZnCl2) =

17、80 mg/100 ml 80 mg Zinkchlorid werden in einem 100-ml-Messkolben in Wasser gelst, bis zur Marke aufgefllt und gemischt. 5.7 Glycylglycin-Pufferlsung, pH = 7,8 7,13 g Glycylglycin (5.5) werden in etwa 70 ml Wasser gelst und mit etwa 15 ml der Natronlauge nach 5.3 auf einen pH-Wert von 7,8 0,1 eingest

18、ellt. Es werden 10 ml Zinkchloridlsung (5.6) hinzugefgt. Die Lsung wird quantitativ in einen 100-ml-Messkolben bergefhrt und mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Die Pufferlsung ist bei 4 C vier Wochen haltbar. 5.8 Reduzierte -Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Dinatriumsalz (-NADH-Na2)-Lsung 50 mg -NADH

19、-Na2(C21H27N7O14P2Na2), Massenanteil w 98 % und 100 mg Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) werden in 10 ml Wasser gelst. Diese Lsung ist bei 4 C vier Wochen haltbar. 5.9 L-Malat-Dehydrogenase/L-Lactat-Dehydrogenase (L-MDH/L-LDH)-Suspension L-MDH aus Schweineherz (EC 1.1.1.37), (L-MDH) = 5 mg/ml in Ammo

20、niumsulfat-Lsung, c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l, spezifische Aktivitt (25 C) etwa 1 200 U/mg1)und L-LDH aus Kaninchenmuskel (EC 1.1.1.27) (L-LDH) = 10 mg/2 ml in Ammoniumsulfat-Lsung, c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l, spezifische Aktivitt (25 C) etwa 550 U/mg. 0,1 ml L-MDH-Suspension und 0,5 ml L-LDH-Suspension we

21、rden mit 0,4 ml Ammoniumsulfat-Lsung c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l gemischt. Die L-MDH/L-LDH-Suspension enthlt 600 U/ml L-MDH und 1 375 U/ml L-LDH. Die Suspension ist bei 4 C ein Jahr haltbar. 1) 1 U (1 Unit) ist die Enzymmenge, die bei einer Temperatur von 25 C unter definierten Bedingungen eine Substrat

22、-menge von 1 mol/min1umsetzt. 5 DIN 10325:2010-07 5.10 Citrat-Lyase(CL)-Lsung Aus Aerobacter aerogenes (EC 4.1.3.6), spezifische Aktivitt etwa 120 U ( 0,25 U/mg Lyophilisat, 25 C). 160 mg Lyophilisat werden mit 1 ml Wasser gelst. Die Lsung ist bei 4 C eine Woche, eingefroren (20 C) 4 Wochen lang hal

23、tbar. ANMERKUNG Es befinden sich Fertig-Reagenzien im Handel, bei deren Verwendung die Arbeitsvorschriften der Prparatehersteller zu bercksichtigen sind. 6 Gerte 6.1 Analysenwaage, Skalenteilungswert 0,1 mg. 6.2 Spektralphotometer, geeignet zum Messen von Absorptionen bei 340 nm mit einer spektralen

24、 Bandbreite von 2 nm. ANMERKUNG Es knnen auch Filterphotometer mit Hg-Lampe, die eine Messung bei 365 nm bzw. 334 nm gestatten, verwendet werden. Die Extinktionskoeffizienten fr NADH (siehe Abschnitt 9) betragen dann 3,4 l mmol1 cm1bzw. 6,18 l mmol1 cm1. 6.3 Messkvetten aus Glas oder Kunststoff, Sch

25、ichtdicke 1 cm, geeignet fr ein Messvolumen von 3,14 ml. 6.4 Eisbad oder Khlschrank. 6.5 Gert zum Zerkleinern von Kse. 6.6 Gert zum Homogenisieren der Probenlsung. 6.7 Faltenfilter, mittelschnell filtrierend, Nenndurchmesser 150 mm. 6.8 Trichter, Durchmesser 70 mm. 6.9 Becherglas, Nennvolumen 25 ml,

26、 100 ml. 6.10 Messkolben, Nennvolumen 100 ml, 1 000 ml. 6.11 Pipetten, zur enzymatischen Analyse geeignet, Nennvolumen 2 ml, 1 ml, 200 l, 100 l, 20 l, z. B. nach DIN 12699. 6.12 Vollpipette, Nennvolumen 50 ml. 6.13 Membranfilter, Porendurchmesser 1,2 m und 0,45 m. 6.14 Zentrifugen 6.14.1 Zentrifuge,

27、 einstellbar auf 12 000 g bis 15 000 g. 6.14.2 Zentrifuge, einstellbar auf (350 50) g. 6.15 Zentrifugengefe 6.15.1 Zenrifugengefe aus Kunststoff, konische Mae 10 mm 40 mm, passend fr Zentrifuge (6.14.1). 6.15.2 Zenrifugengefe aus Glas, mit Stopfen, zylindrische Mae etwa 22 mm 110 mm, passend fr Zent

28、rifuge (6.14.2). 6 DIN 10325:2010-07 6.16 Wasserbad, einstellbar auf 65 C 2 C. 6.17 pH-Messeinrichtung, bestehend aus pH-Messgert, geeignet zur Messung auf 0,01 pH-Einheiten; sowie Glas- und Bezugselektrode, geeignet zur Messung bei 20 C. ANMERKUNG Glas- und Bezugselektrode knnen auch als Kombinatio

29、nselektrode (Einstabmesskette) zusammen-gefasst sein. 6.18 Magnetrhrer. 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 707. 8 Durchfhrung 8.1 Vorbereitung der Probe 8.1.1 Milch Die Milchprobe wird sorgfltig durchgemischt. 8.1.2 Kse Vor der Analyse wird die Rinde, die schmierige Auenseite oder die Schimmel-Oberflchens

30、chicht des Kses so entfernt, dass eine Untersuchungsprobe erhalten wird, die fr den Kse im blichen Verzehrzustand reprsentativ ist. Die Untersuchungsprobe wird mittels eines geeigneten Gertes (6.5) zerkleinert. Hartkse und halbfeste Kse werden vorab vorzugsweise in Wrfel von etwa 15 mm Kantenlnge ge

31、schnitten. Die Wrfel werden durch Schtteln in einem Gef gemischt. Die Untersuchungsprobe wird dann wie oben angegeben zerkleinert. Die zerkleinerte Probe wird schnell durchmischt und, wenn es bei halbfesten und Hartksen erforderlich ist, ein zweites Mal zerkleinert und erneut grndlich durchmischt. K

32、seproben, die nicht wie oben beschrieben zerkleinert werden knnen, werden durch intensives Kneten grndlich durchmischt. Die Untersuchungsprobe wird bis zum Beginn der Untersuchung in einem luftdichten Gef gelagert. Whrend der gesamten Probenvorbereitung ist ein Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden. 8.1

33、.3 Schmelzkse Die Probe wird je nach Konsistenz vor der Untersuchung mit einem Zerkleinerungsgert (gegebenen-falls Homogenisator) zerkleinert und gut durchgemischt, damit eine reprsentative Untersuchungsprobe erhalten wird. 7 DIN 10325:2010-07 8.1.4 Butter 8.1.4.1 Die Untersuchungsprobe wird in dem

34、luftdicht verschlossenen Behltnis auf hchstens 35 C erwrmt. Falls eine Fettabtrennung zu erwarten ist (z. B. bei fettarmen Untersuchungsproben oder aufgrund von Erkenntnissen aus der Laborpraxis), sind solche Untersuchungsproben im luftdicht verschlossenen Behltnis zu erwrmen bis eine eher typische

35、Homogenisierungstemperatur von 24 C bis 30 C erreicht ist. Die Untersuchungsprobe wird im verschlossenen Behltnis bis zur Homogenitt grndlich durchmischt (entweder mit einem mechanischen Gert oder von Hand), ohne dabei die Emulsion zu beschdigen. Durch geeignete Vorkehrungen ist sicherzustellen, das

36、s Feuchtigkeitsverluste vermieden werden. 8.1.4.2 Das Probenbehltnis wird geffnet und die Untersuchungsprobe vor dem Wgen mit einem geeigneten Gert, z. B. einem Lffel oder Spatel, fr hchstens 10 s umgerhrt. 8.1.5 Pulverfrmige Milcherzeugnisse Das Pulver wird auf Raumtemperatur gebracht. Nach dem ffn

37、en der Packung wird der gesamte Inhalt mglichst schnell mit einem Glasstab oder einem geeigneten Mischgert gemischt. Anschlieend wird die Einwaage fr die Bestimmung unverzglich durchgefhrt. 8.2 Herstellen der Probenlsungen von Milch, Kse, Schmelzkse und -zubereitungen und pulverfrmigen Milcherzeugni

38、ssen 8.2.1 Herstellung des wssrigen Extraktes Etwa 1 g bis 2 g der nach 8.1.1, 8.1.2, 8,1.3 vorbereiteten Probe werden auf 1 mg in ein 100-ml-Becherglas eingewogen und mit etwa 60 ml heiem bidestillierten Wasser (etwa 50 C) vermischt. Die Mischung wird auf einem Magnetrhrer (6.18) so lange gerhrt, b

39、is die Probenmasse homogen verteilt ist (etwa 5 min bis 10 min). Nach dem Abkhlen wird die homogene Mischung in einen 100-ml-Messkolben bergefhrt, das Becherglas mit Wasser nachgesplt. Das Waschwasser wird in den Messkolben gegeben und dieser mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Nach grndlichem Misch

40、en wird der Messkolben etwa 10 min in einen Khlschrank (6.4) gestellt. Hiernach wird der Inhalt des Messkolbens durch ein Faltenfilter (6.7) filtriert. Ein Aliquot des trben Filtrates wird durch ein Membranfilter 0,45 m (6.13) filtriert. Das Membranfiltrat stellt die Probenlsung dar. ANMERKUNG Mit A

41、usnahme von Milchpulver kann zur Bestimmung auch der von Fett und Eiwei befreite wssrige Extrakt eingesetzt werden. 8.2.2 Extraktion mit TCA-Fllung Etwa 2 g der nach 8.1.1, 8.1.2, 8.1.3 und 8.1.5 vorbereiteten Probe werden auf 1 mg in ein 100-ml-Becherglas (6.9) eingewogen. Die Proben werden mit etw

42、a 30 ml warmem Wasser (40 C bis 50 C) versetzt. Der Probenansatz wird mit dem Homogenisiergert (6.6) etwa 1 min bzw. bis zum Erreichen einer homogenen Mischung gemixt. Am Homogenisiergert anhaftende Probenreste werden mit etwa 20 ml Wasser vollstndig in das Becherglas bergesplt. Die Mischung wird qu

43、antitativ in einen 100-ml-Messkolben (6.10) bergefhrt. Danach werden 10 ml Trichloressigsurelsung (5.2) zugegeben. Es wird mit Wasser bei 20 C bis zur Marke aufgefllt und gemischt. Nach 30 min Standzeit wird durch ein Faltenfilter (6.7) filtriert, die ersten Anteile des Filtrates werden verworfen. 8

44、.2.3 pH-Werteinstellung 50 ml des Filtrates nach 8.2.2 werden in ein 100-ml-Becherglas (6.9) pipettiert (6.12) und mit Natronlauge (5.3), (5.4) unter Verwendung eines pH-Meters (6.17) auf pH = 8 0,1 eingestellt. Danach wird das Filtrat quantitativ in einen 100-ml-Messkolben (6.10) bergesplt und mit

45、Wasser bei 20 C bis zur Marke aufgefllt, gemischt und nochmals durch ein Faltenfilter (6.7) filtriert, wobei die ersten Anteile des Filtrates wiederum verworfen werden. 8 DIN 10325:2010-07 8.3 Herstellen der Probenlsung von Butterplasma 8.3.1 Ein Zentrifugengef (6.15.2) wird in die nach 8.1.4 vorber

46、eitete Butterprobe gedrckt, bis dieses zu 3/4 der Lnge gefllt ist (etwa 80 g bis 90 g Probe), anschlieend einseitig mit einem Stopfen verschlossen und zum Schmelzen der Probe bei 65 C in ein Wasserbad (6.16) gestellt. Sobald die Butter geschmolzen ist, wird zur Trennung Butterplasma/Butterl das Zent

47、rifugengef mit dem Stopfen nach unten in die Zentrifuge (6.14.2) gesetzt und sofort 10 min zentrifugiert. Unmittelbar danach wird das Zentrifugengef mit dem Stopfen nach unten in einen Khlschrank (6.4) gestellt und bis zum Erstarren der Fettphase dort belassen. Daraufhin wird das Butterplasma in ein

48、 25-ml-Becherglas (6.9) abgegossen und durchmischt. ANMERKUNG Das Butterplasma kann bis zur Analyse bei 20 C gelagert werden. 8.3.2 100 l des nach 8.3.1 erhaltenen Butterplasmas werden zu 900 l Wasser in ein Zentrifugengef (6.15.1) gegeben und gemischt und dann 10 min in der Zentrifuge (6.14.1) zentrifugiert. Der berstand wird durch ein Membranfilter 1,2 m (6.13) filtriert. 8.4 Blindwert 8.4.1 Blindwert bei Milch, Kse, Schmelzkse und -zubereitungen sowie pulverfrmigen Milcherzeugnissen Der Blindwert ist wie in 8.2.1 bzw. 8.2.2 beschrieben mit