DB12 T 465-2012 预防性健康检查沙门氏菌志贺氏菌的检测方法.pdf

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1、 ICS 13.100 C 75 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB 12/ T4652012 预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、 志贺氏菌的检测方法 Detection methods of Salmonella and Shigella who need to pass preventive health check 2012 - 11 - 14发布 2013 - 02 - 15实施天津市质量技术监督局 发 布 DB 12/ T4652012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的标准文本的格式和文字进行编写。 本标准由天津市南开

2、区疾病预防控制中心提出。 本标准起草单位：天津市南开区疾病预防控制中心、天津正大乾坤生物科技有限公司。 本标准主要起草人：柳光斌、陈金枝、庞作章、马均彪、王 楠、于 磊、沈宗林。 DB 12/ T4652012 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.1.2条采便管与微生物采样增菌培养管内容的采便套管和采便棒相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联

3、系方式获得： 专利持有人姓名：马均彪 地址：天津市南开区东马路新安花园A-1-604 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 1DB 12/ T4652012 志贺氏菌的检测方法志贺氏菌的检测方法 1 范围 本标准规定了预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法的术语和定义、设备和实验器具、培养基和试剂、检验程序、操作步骤以及结果报告。 本标准适用于疾病预防控制机构和医疗机构对食品、公共场所等行业从业人员，进行沙门氏菌和志贺氏菌健康带菌者的检测和确认。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 采便管 Collecti

4、ng pipe 由采便套管和采便棒构成的采便装置，采便套管内装有经钴60辐射灭菌的SN液体增菌液培养基。 2.2 带菌者 Carriers 无任何临床表现，从粪便中分离到沙门氏菌（伤寒和副伤寒菌）或志贺氏菌的人群。 3 设备和实验器具 3.1 冰箱：48。 3.2 恒温培养箱：361。 3.3 电子天平：感量0.1 g。 3.4 锥形瓶:容量500 mL，250 mL。 3.5 无菌培养皿：直径90 mm。 4 培养基和试剂 4.1 沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（SN）：见附录A 中A.1。 4.2 沙门氏菌、志贺氏菌（SS）琼脂培养基：见附录A 中A.2。 4.3 HE 琼脂：见附录A 中A.3

5、。 4.4木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A 中A.4。 2DB 12/ T4652012 4.5克氏双糖铁琼脂（KIA）见附录A 中粪便A.5。 4.6三糖铁（TSI）琼脂：见附录A 中粪便A.6。 4.7 动力-吲哚-尿素（MIU）培养基：见附录A 中A.7。 4.8 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A 中A.8。 4.9 氰化钾 （KCN） 培养基：见附录A 中A.9。 4.10 赖氨酸铁琼脂（LIA）：见附录A 中A.10。 4.11 糖发酵管：见附录A 中A.11。 4.12 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A 中A.12。 4.13 半固体琼脂：见附录A 中A.

6、13。 4.14 丙二酸钠培养基：见附录A 中A.14。 4.15 沙门氏菌属O、H 和Vi诊断血清。 4.16 志贺氏菌属诊断血清 5 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序 沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序见图1： 3DB 12/ T4652012 361 18h24h 图1 沙门氏菌、志贺氏菌检验程序图 6 操作步骤 6.1 粪便标本采集 6.1.1 肛拭子采便 手持灭菌直肠棉拭子先用无菌生理盐水中浸湿，由肛门插入直肠3cm5cm处，旋转360o采集后，将棉拭子手持端折断弃去，棉拭子端放入灭菌的SN增菌液培养管中。 6.1.2 采便管采便 手持采便管中的采便棒由肛门插入直肠3cm5cm处，旋转3

7、60o采集后，将采便棒放入灭菌的SN增菌液培养管中。 6.1.3 现场留便 体检者在现场自行留取约1g粪便并及时接种灭菌的SN增菌液培养基中。 6.2 增菌 361 361 粪便采集 接种SN增菌液 HE或XLD或SS琼脂平板和 麦康凯琼脂平板分离 挑取可疑菌落 接种KIA或TSI，及MIU、LIA 血清学分型 系统生化鉴定 报告 18h24h 18h24h 4DB 12/ T4652012 将肛拭子采便或采便管采便或自行留便的SN增菌液培养管，置361，培养18h24h。 6.3 分离 分别用接种环取增菌液一环，划线接种一个HE琼脂平板或XLD琼脂平板或SS琼脂平板和麦康凯琼脂平板，于361

8、培养18h24h，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上菌落特征见表1。 表1 沙门氏菌属、志贺氏菌在选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性平板 沙门氏菌 志贺氏菌 HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 无色透明、半透明。 XLD琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 无色透明、半透明。 SS琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株菌落中心带黑色。 无色透明、半透明。 麦康凯琼脂 无色透明、半透明。 无色透明、半透明。 6.4 初步生化鉴定试验 6.4.1 沙

9、门氏菌（伤寒及副伤寒菌）的初步生化鉴定 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁（TSI）琼脂和动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA），于361，培养18h24h。沙门氏菌初步生化鉴定见表2。 表2 沙门氏菌的初步生化鉴定 KIA（TSI） MIU LIA 底层/斜面 气 体 硫 化 氢 动 力 吲 哚 尿 酶 赖 氨 酸 硫 化 氢 初步判断 A/K 可疑沙门氏菌属 A/K / 可疑沙门氏菌属 A/K 可疑沙门氏菌属 A/A 可疑沙门氏菌属 A/K 非沙门氏菌 A/A 非沙门氏菌 A/K 非沙门氏菌 A/A / / / 非沙门氏

10、菌 注：A：产酸（黄色）；K：不产酸（红色）；：阳性；：阴性；/：多数阳性；/：多数阴性。 5DB 12/ T4652012 6.4.2 志贺氏菌的初步生化鉴定 自选择性分离平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁（TSI）琼脂及动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA）。每份标本应多挑几个菌落，于361，培养18h24h。志贺氏菌初步生化鉴定见表3。 表3 志贺氏菌初步的生化鉴定 KIA（TSI） MIU LIA 底层/斜面 气 体 硫 化 氢 动 力 吲 哚 尿 酶 赖 氨 酸 硫 化 氢 初步判断 A/K / 可疑志贺氏菌属 注：1、A：产

11、酸（黄色）；K：不产酸（红色）；：阳性；：阴性；/：多数阳性；/：多数阴性。 2、为福氏6型的某些生物型、鲍氏13及14某些生物型产气。 6.5 血清学分型鉴定试验 6.5.1 沙门氏菌血清玻片凝集试验 挑取符合沙门氏菌生化反应的KIA或TSI斜面上菌苔先与AFO多价血清进行玻片凝集，凝集阳性者（生理盐水不凝集），再选用O-2、O-4、O-7、O-8、O-9等因子血清凝集，沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，必要时制成浓菌悬液经100水浴30min破坏Vi抗原后，再进行抗O血清的凝集。O抗原确定后再用H因子诊断血清凝集以确定菌型见表4。检出沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）以

12、外的沙门氏菌时其抗原的鉴定可参见附录B（常见沙门氏菌抗原表）进行鉴定。沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）具有Vi抗原应与Vi诊断血清进行血清凝集试验。 表4 沙门氏菌型抗原鉴定表 H抗原 菌种名称 O抗原 相 相 表面抗原 甲型副伤寒沙门氏菌 2 a 乙型副伤寒沙门氏菌 4 b 1,2 丙型副伤寒沙门氏菌 7 c 1,5 Vi 伤寒沙门氏菌 9 d Vi 注： 表示无此项抗原。 6.5.2志贺氏菌血清玻片凝集试验 a) 挑取 KIA(TSI)疑似志贺氏菌的培养物，先用志贺氏菌四种多价血清做玻片凝集试验。如呈现凝集，则用B群（福氏）多价、D群（宋内）血清及志贺2型、志贺1型分别进行凝集试验。 b)

13、与B群（福氏）多价血清凝集的培养物，则用群3，4、6、7，8因子血清进行凝集试验，根据群因子血清的凝集的结果再选用1型6型分型血清进行凝集试验，鉴定出型和亚型（见表6、表7）。 6DB 12/ T4652012 c) 与志贺四种多价血清不凝集的培养物，应用C群鲍氏多价血清及1型19型因子血清进行检查。若鲍氏血清不凝集，再用A群3型15型多价及分型血清进行检查。 d) 若与上述血清均不凝集应进行生化鉴定，若生化反应符合志贺氏菌定义应注意该菌是否带有K抗原，将该菌制成浓菌液100水浴30min（破坏K抗原）,待菌液凉至室温再进行血清学鉴定。 e) 若四种多价血清凝集，而不与相应的分型血清凝集，且菌

14、落粗糙，可用宋内相（粗造型）血清做凝集反应,见表6、表7。 表6 福氏志贺氏菌型和亚型的型抗原和群抗原鉴定表 群因子血清凝集 型和亚型 型抗原 3，4 6 7，8 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 6 （） X变种 / Y变种 / 注：表示凝集；表示不凝集；（）表示个别菌株系阴性反应。 表7 福氏志贺氏菌的血清学简化鉴定表 在群因子血清中的凝集反应 3，4 6 7，8 可能的血清型 2a、1a、4a、5a、6、y 1b、 3b 、4b 2c 3a 3c 1c、2b、4c、5b、X变种 6、4 注：表示凝集；表示不凝集。 7DB 12/ T465

15、2012 6.6 系统生化鉴定试验 6.6.1 沙门氏菌的系统生化鉴定试验 6.6.1.1 生化管鉴定法 自6.4.1初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。采用传统生化管鉴定沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)的鉴定见表8。 表8沙门氏菌的系统生化鉴定 菌种名称 动力 葡 萄 糖 乳 糖 蔗 糖 硫 化 氢 靛基 质 尿素 甲基 红 VP 枸橼 酸盐 卫茅 醇 木胶 糖 赖氨 酸脱 羧酶 鸟氨 酸脱 羧酶 伤寒沙门氏菌 / 甲型副伤寒沙门氏菌 / 乙型副伤寒沙门氏菌 / 丙型副伤寒沙门氏菌 注：阴性（不产酸）；：阳性（产酸）；：产酸产气；/：多数阳性，少数阴性；/：多数阴性，少数阳性。

16、6.6.1.2 生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统法 根据6.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)鉴定。 6.6.2 志贺氏菌的系统生化鉴定试验 6.6.2.1 生化管鉴定法 6.6.2.1.1 自6.4.2初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰染色检查和氧化酶试验

17、，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。 6.6.2.1.2 已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表9。 表9 志贺氏菌的系统生化鉴定 生化群 5%乳糖 甘露醇 棉子糖 甘油 靛基质 A群：痢疾志贺氏菌 - - - （+） -/+ B群：福氏志贺氏菌 - + + - （+） C群：鲍氏志贺氏菌 - + - （+） -/+ D群：宋内氏志贺氏菌 +/（+） + + d

18、 - 注：+：阳性；-：阴性；-/+：多数阴性，少数阳性；（+）：迟缓阳性；d：有不同生化型。 8DB 12/ T4652012 6.6.2.2 生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统法 可根据6.4.2 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行志贺氏菌鉴定。 6.7 结果报告 综合上述生化试验和血清学鉴定的结果判定菌型，并报告粪便标本中检出或未检出沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)或志贺氏菌。 9DB 12/ T4652012 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（

19、SN） A.1.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L-胱氨酸 0.01 g 增菌改良剂1 0.05 g 增菌改良剂2 0.1 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2 A.1.2 制法 除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷却至55 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10mL（称取0.1 g L-胱氨酸，加1mol/L 氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100 mL 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。 A.2 沙门、志贺氏菌属（SS）琼脂培养基

20、A.2.1 基础培养基 蛋白胨 5.0 g 牛肉浸出粉 5.0 g 三号胆盐 3.5 g 蒸馏水 1000 mL 将蛋白胨、牛肉粉和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏水中，煮沸溶解，再将两夜混合121高压灭菌15min，保存备用。 A.2.2 完全培养基 基础培养基 1000 mL 乳糖 10 g 柠檬酸钠 8.5 g 硫代硫酸钠 8.5 g 10%柠檬酸铁溶液 10 mL 1%中性红溶液 2.5mL 10DB 12/ T4652012 0.1%煌绿溶液 0.33mL pH 7.00.1 加热溶化基础培养基，按比例加入上述除染料以外之成分，充分混合均匀，调节pH，加入中性

21、红和煌绿溶液，倾注平板。 注1：制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内48h内使用。 注2：煌绿溶液配好后应在10d内使用。 注3：可以购用SS琼脂的干燥培养基。 A.3 HE 琼脂（Hektoen Enteric Agar） A.3.1 成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2.0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0g20.0 g 蒸馏水 1000 mL 0.4溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mL Andrade 指示剂 20.0 mL 甲液 20.0 mL 乙液 20.0 mL pH 7.50.1 A.3.2 制

22、法 将前面七种成分溶解于400 mL 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 mL 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至5055倾注平皿。 注4：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。 注5：甲液的配制：硫代硫酸钠34.0g、柠檬酸铁铵4.0g、蒸馏水100mL。 注6：乙液的配制：去氧胆酸钠10.0g、蒸馏水100mL。 注7：Andrade指示剂：酸性复红0.5g、1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL、蒸馏水100mL，将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加

23、氢氧化钠溶液1mL2 mL。 A.4 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.4.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 11DB 12/ T4652012 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.20.2 A.4.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至5055倾注平皿

24、。 注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.5 克氏双糖铁琼脂（KIA） A.5.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 酵母膏 3.0 g 乳 糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 氯化钠 5.0 g 柠檬酸铁铵 0.5 g 硫代硫酸钠 0.5 g 琼 脂 12.0 g 酚 红 0.025 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 A.5.2 制法 将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜

25、多些，以便得到比较高的底层。121高压灭菌15min。放置高层斜面备用。 A.6 三糖铁（TSI）琼脂 A.6.1 成分 12DB 12/ T4652012 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳 糖 10.0 g 蔗 糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵（含6 个结晶水） 0.2 g 酚 红 0.025 g 或5.0 g/L 溶液5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼 脂 12.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中

26、，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2mL4mL，高压灭菌121 10min 或115 15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。 A.7 动力-吲哚-尿素（MIU）培养基 A.7.1 成分 蛋白胨 28g 氯化钠 5g 胰蛋白胨 2g 酚红 0.005g 磷酸二氢钾 1g 琼脂 4g pH6.80.2 A.7.2 制法 除酚红外，将其他成分加入900 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.8，加入0.4%酚红溶液1.25mL，加热煮沸至完全溶解，121高压灭菌15min，冷至55无菌加入40%尿素溶液5mL，混匀，分装无菌试管，毎管4mL直立放置待凝固后

27、备用。 A.8 蛋白胨水、靛基质试剂 A.8.1 蛋白胨水 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.2 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121 高压灭菌15 min。 13DB 12/ T4652012 A.8.2 靛基质试剂 A.8.2.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。 A.8.2.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。 A.8.3 试验方法 挑取培养物接种,在361培养1d2d，必要时可培养4d5d。加

28、入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 A.9 氰化钾 （KCN） 培养基 A.9.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1 000 mL 0.5氰化钾 20.0 mL A.9.2 制法 将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121 高压灭菌15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL 培养基加入0.5氰化

29、钾溶液2.0 mL（最后浓度为1:10 000），分装于无菌试管内,每管约4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。 A.9.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在361培养1d2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2 d 细菌不生长为阴性（抑制）。 注：氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细

30、菌生长，因而造成假阳性反应，试验时对每一环节都要特别注意。 A.10 赖氨酸铁琼脂（LIA） A.10.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g L-赖氨酸 10.0g 14DB 12/ T4652012 枸橼酸铁铵 0.5g 硫代酸硫酸钠 0.04g 溴甲酚紫 0.02g 琼脂 15g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.70.1 A.10.2 制法 分装4mL于100mm12mm试管中，121灭菌12min，斜置试管使成深高层和短斜面。 A.10.3 试验方法 用接种针穿刺高层二次和斜面划线接种。于36 1培养18h24h (必要时培育48h)，观察结果。氨基

31、酸脱羧酶阳性者由于产碱，高层和斜面呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基底层变为黄色。 A.11 糖发酵管 A.11.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 2.0 g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.2 A.11.2 制法 A.11.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15min。 A.11.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL，121高压灭菌15min。另将各种糖

32、类分别配好10溶液，同时高压灭菌。将5mL 糖溶液加入于100mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 A.11.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养,一般2d3d，迟缓反应需观察14d30d。 A.12 ONPG 培养基 A.12.1 成分 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG） 15DB 12/ T4652012 （O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside） 60.0 mg 0.01mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.5） 10.0 mL 1蛋白胨水（pH7.5） 30.0 mL A.12.2 制

33、法 将ONPG 溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，用橡皮塞塞紧。 A.12.3 试验方法 自琼脂斜面上挑取培养物1满环，接种于361培养1h3h和24h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于1h3h 变黄色，如无此酶则24h不变色。 A.13 半固体琼脂 A.13.1 成分 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35g0.4 g 蒸馏水 100 mL pH 7.40.2 A.13.2 制法 按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH，分装小试管，121高压灭菌15min，直立凝固备用。 注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相

34、变异试验等用。 A.14 丙二酸钠培养基 A.14.1 成分 酵母浸膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷酸二氢钾 0.4 g 氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000 mL pH 6.80.2 A.14.2 制法 除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min。 16DB 12/ T4652012 A.14.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。 17DB 12/ T4652012 B B 附 录 B （规范性附录）

35、常见沙门氏菌抗原 B.1 常见沙门氏菌抗原 常见沙门氏菌抗原见表B.1 表B.1 常见沙门氏菌抗原表 H 抗菌 名 拉丁菌名 O 抗 原 第 1 相 第 2 相 A 群 甲型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi A 1，2，12 a 1,5 B 群 基桑加尼沙门氏菌 S .kisangani 1,4,5,12 a 1,2 阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 S. arechavaleta 4,5,12 a 1,7 马流产沙门氏菌 S. abortusequi 4,12 - e,n,x, 乙型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi B 1,4,5,12 b 1,2 利密特沙门氏菌 S. limete 1

36、,4,12,27 b 1,5 阿邦尼沙门氏菌 S. abony 1,4,5,12,27 b e,n,x 维也钠沙门氏菌 S. wien 1,4,12,27 b l,w 伯里沙门氏菌 S .bury 4,12,27 c z6 斯坦利沙门氏菌 S. stanley 1,4,5,12,27 d 1,2 圣保罗沙门氏菌 S. saintpaul 1,4,5,12 e,h 1,2 里定沙门氏菌 S .reading 1,4,5,12 e,h 1,5 彻斯特沙门氏菌 S. chester 1,4,5,12 e,h e,n,x 德尔卑沙门氏菌 S. derby 1,4,5,12 f,g 1,2 阿贡纳沙门氏

37、菌 S. agona 1,4,5,12 f,g,s 1,2 埃森沙门氏菌 S. essen 4,12 g,m - 18DB 12/ T4652012 表B.1（续） 加利福尼亚沙门氏菌 S. california 4,12 g,m,t z67 金斯敦沙门氏菌 S. kingston 1,4,5,12,27 g,s,t 1,2 布达佩斯沙门氏菌 S. budapest 1,4,12,27 g,t - 鼠伤寒沙门氏菌 S. typhimurium 1,4,5,12 i 1,2 拉古什沙门氏菌 S. Lagos 1,4,5,12 i 1,5 布雷登尼沙门氏菌 S.bredeney 1,4,12,27

38、 l,v 1,7 基尔瓦沙门氏菌 S.kilwa 4,12 l,w e,n,x 海德尔堡沙门氏菌 S.heidelberg 1,4,15,12 r 1,2 印地安纳沙门氏菌 S.indiana 1,4,12 z 1,7 斯坦利维尔沙门氏菌 S.stanleyville 1,4,5,12.27 z4,z23 1,2 伊图里沙门氏菌 S.ituri 1,4,12 z10 1,5 C1 群 奥斯陆沙门氏菌 S.oslo 6,7,14 a e,n,x 爱丁保沙门氏菌 S.edinburg 6,7, 14 b 1,5 布隆方丹沙门氏菌 S.bloemfontein 6,7 b e,n,x：z42 丙型副

39、伤寒沙门氏菌 S.paratyphi C 6,7,Vi c 1,5 猪霍乱沙门氏菌 S.choleraesuis 6,7 c 1,5 猪伤寒沙门氏菌 S.typhisuis 6,7 c 1,5 罗米他沙门氏菌 S.lomita 6,7 e,h 1,5 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7, 14 e,h e,n,z15 里森沙门氏菌 S.rissen 6,7, 14 f,g - 蒙得维的亚沙门氏菌 S.montevideo 6,7, 14 g,m,p,s 1,2,7 里吉尔沙门氏菌 S.riggil 6,7 g,t - 奥雷宁堡沙门氏菌 S.oranieburg 6,7, 14

40、 m,t 2,5,7 奥里塔蔓林沙门氏菌 S.oritamerin 6,7 i 1,5 汤卜逊沙门氏菌 S.thompson 6,7, 14 k 1,5 康科德沙门氏菌 S.concord 6,7 l,v 1,2 19DB 12/ T4652012 表B.1（续） 伊鲁木沙门氏菌 S.irumu 6,7 l,v 1,5 姆卡巴沙门氏菌 S.mkamba 6,7 l,v 1,6 波恩沙门氏菌 S.bonn 6,7 l,v e,n,x 波茨坦沙门氏菌 S.potsdam 6,7, 14 l,v e,n,z15 格但斯克沙门氏菌 S.gdansk 6,7, 14 l,v z6 维尔肖沙门氏菌 S.v

41、irchow 6,7, 14 r 1,2 婴儿沙门氏菌 S.infantis 6,7, 14 r 1,5 巴布亚沙门氏菌 S.papuana 6,7 r e,n,z15 巴累利沙门氏菌 S.bareilly 6,7, 14 y 1,5 哈特福德沙门氏菌 S.hartford 6,7 y e,n,x 三河岛沙门氏菌 S.mikawasima 6,7, 14 y e,n,z15 姆班达卡沙门氏菌 S.mbandaka 6,7, 14 z10 e,n,z15 田纳西沙门氏菌 S.tennessee 6,7, 14 z29 1,2,7 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7, 14 e,

42、h e,n,z15 耶路撒冷沙门氏菌 S.jerusalem 6,7, 14 z10 l,w C2 群 习志野沙门氏菌 S.narashino 6.8 a e,n,x 名古屋沙门氏菌 S.nagoya 6,8 b 1,5 加瓦尼沙门氏菌 S.gatuni 6,8 b e,n,x 慕尼黑沙门氏菌 S.muenchen 6,8 d 1,2 蔓哈顿沙门氏菌 S.manhattan 6,8 d 1,5 纽波特沙门氏菌 S.newport 6,8,20 e,h 1,2 科特布斯沙门氏菌 S.kottbus 6,8 e,h 1,5 茨昂威沙门氏菌 S.tshiongwe 6,8 e,h e,n,z15 林

43、登堡沙门氏菌 S.lindenburg 6,8 i 1,2 塔科拉迪沙门氏菌 S.takoradi 6,8 i 1,5 波那雷恩沙门氏菌 S.bonariensis 6,8 i e,n,x 20DB 12/ T4652012 表B.1（续） 利齐菲尔德沙门氏菌 S.litchfield 6,8 l,v 1,2 病牛沙门氏菌 S.bovismorbificans 6,8, 20 r,i 1,5 查理沙门氏菌 S.chailey 6,8 z4,z23 e,n,z15 C3 群 巴尔多沙门氏菌 S.bardo 8 e,h 1,2 依麦克沙门氏菌 S.emek 8,20 g,m,s - 肯塔基沙门氏菌 S.kentucky 8, 20 i z6 D 群 仙台沙门氏菌 S.sendai 1,9,12 a 1,5 伤寒沙门氏菌 S.typhi 9,12,Vi d - 塔西沙门氏菌 S.tars