GB T 19439-2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法.pdf
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1、GB/T 19439-2004 前言高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型i流感病毒引起,世界动物卫生组织COJE)列为A类疾病,我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术CNASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当,并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上,参考。IE(诊断试验和疫苗标准手册)(2000年版),并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录,附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出入境检验检疫
2、局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位2中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。本标准起草人:单松华、陈家华、谢燕、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。I GB/T 19439-2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法1 范围本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准
3、,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是沓可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件,其最新版本适用于本标准。G B/T 18936 , , 2003 高致病性禽流感诊断技术3 原理N ASBA (N ucleic acid seq uence- based am叫plif们lcat续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶)和两条寡核背酸引物。上游引物5F末端含有噬囱体T7的依赖于D:-.JA的RIA聚合酶的启动子序列,下游引物的5末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列口在扩增步骤中,两个5 端都整合进扩增序列中,这样既
4、成为产生互补RNA序列的模板,又能特异性结合检测步骤中的ECL探针。扩增底物与ECL探针形成复合物,携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECLl反应。己杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。4 材料准备4. 1 试验环境干净的环境,最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。4.2 器材采用常规的分子生物学器材,包括:一次性手套、移液器(量程5f1L到200L)、枪头、无RNA酶的1. 5 mL塑料离心管、1.5 mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精度士2C)、加热器、水浴锅、5mL聚丙
5、烯试管(VWR)、封口膜等。如果采用ECL方法,需要NucliSens阅读器或者等同的仪器。如果采用ELISA方法,需要酶标仪。4. 3号!物上游引物AATTCT AAT ACG ACT CAC TAT AGGGAG AAG G CCA IAA AGA (C/TlAG ACC AGC TA 下游引物GATGCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA GAA GAA GAA AAA AGA GAG GAC 4.4 检测试剂所有检测试剂在使用前,使其达到室温。a) 裂解缓冲液:5 mol/L异硫氨酸肌,10%Trito口X-100,10mmol/LTris-HCl, pH 8.3; bl
6、 冲洗缓冲液5mol/L异硫氨酸肌,10mmol/LTris-HCl,pH8.3; c) 500 mg/mL硅土:500 mg/mL盐酸活化的二氧化硅;1 GB/T 19439-2004 d) 洗脱缓冲液10mmol/L Tris-HCl , pH 8.3 , e) 酶溶液(参见附录A), f) H5捕捉探针,10mmol/L生物素化寡聚核背酸;探针序列为Biotin-GCCA/G)AGT TCCC/ T) CTA GCA CTG GCA AT g) 电化学发光1.1;属别检测探针(10mMgeneric ECL detection probe) :钉标记的DNA寡聚核背酸;ECL序列为GAT
7、GCA AGG TCG CAT ATG AG GT GACC/T) AAT GAA TGCC/T) ATG GAA h) 仪器调试参照液,10 mmol/L NASBA CP , 1 mmol/L Tris-HCl pH8. 3, 3 mmol/L NASBA ECL, i) 检测稀释液,15mmol/LTris-HCl, pH 8.3 , j) 分析缓冲液,50mmol/LTris-HCl, pH 8. 3, 1XPBSCl 37 mmol/L NaCl , 2.7 mmol/L KCl , 10 mmol/L Na, HPO, , 2 mmol/L KH2PO,), k) 清洗液,100r
8、nmol/L KOH , 10%SDS, 10% Triton X-l00 , l) 元水乙醇。4.5 样晶采集、保存、处理按GB/T18936-2003中2.1进行。5 操作方法5. 1 核酸释放和提取按以下顺序za) 将0.1mL样品加入盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合;b) 振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加入50L;c) 振荡混合均匀;d) 室温下温育10minC每2min振荡混合次,防止硅土沉淀he) 在12000 r/min下离心裂解缓冲液管30问f) 小心移除上清液(不要搅动沉淀)后,向每个管中加入1mL冲洗缓冲液;g) 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止;h) 在120
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