GB T 19438.4-2004 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法.pdf
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1、GB/T 19438.4-2004 前言GBjT 19438-2004 (禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分gGBjT 19438.1-2004 (禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法h一GBjT19438.2-2004 (H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法hGBjT 19438.3-2004 ( H7亚型禽流感病毒荧光RT一PCR检测方法以GBjT 19438.4-2004 (H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工
2、程股份有限公司。本部分主要起草人:张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。I GB/T 19438.4-2004 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1 范围本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。GB/T 19438.1 2004 禽流感病
3、毒通用荧光RT-PCR检测方法3 缩赂语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。3. 2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阑值时所经历的循环数。3. 3 RNA 核糖核酸。3.4 DEPC 焦碳酸乙二醋。3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。3.6 Tq酶Taq DNA聚合酶。4 原理H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术。设计一对仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5端和3端分别标记不同的荧光素,如5端标记FAM荧光素,它发出的荧光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团(用R表示) 3
4、端一般标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5端报告荧光基因发出的荧光信号,称为洋灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发GB/T 19438.4-2004 出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时,T叫酶在引物的引导下,以四种核昔酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链;当链的延伸进行J探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的f3外切核酸酶的功能,将探针切成单核音酸,消除阻碍,与此同时标记在探针上的R基因游离出来,R所发出的荧光再不为Q所吸收
5、而被检测仪所接收g在T叫酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游离于溶液中,仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。5 材料与试剂5. 1 试剂除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5. 1. 1 三氯甲:烧。5. 1. 2 异丙醇(-20C预冷)。5. 1. 3 PBS:配方见GB/T19438. 1-2004中附录A.121C士2C, 15 min高压灭菌冷却后,元菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL. 5. 1. 4 75 %乙醇2用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制,-20C预冷。5. 1.
6、5 日9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒.组成、说明及使用注意事项参见附录A.5.2 仪器与器材5. 2. 1 荧光RT-PCR检测仪。5.2.2 高速台式冷冻离心机(最高转速12000 r/min以上)。5.2.3 台式离心机(最高转速2000r/min)。5.2.4 混匀器。5.2.5 冰箱(2C8C和20C两种)。5.2.6 可移动紫外灯。5.2.7 微量可谓移液器及配套带滤芯吸头(10L、100L、1000L)。5.2.8 专用毛细玻璃管或PCR管。5.2. 9 Eppendorf管(1.5mL)。6 抽样6. 1 采样工具下列采样工具必须经121C土2C,15min高压灭菌并
7、烘干2一二棉拭子;一二剪刀、银子,一二注射器,一二1.5 mL Eppendorf管;一二研钵。6.2 样晶采集6. 2. 1 活禽2 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下2一二取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上顿裂来回刮3次5次取咽喉分泌液z1 )由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。GB/T 19438.4-2004 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便,将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL Eppendorf管中,加盖、编号。6.2.2 肌肉
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