GB T 19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法.pdf
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1、GB/T 19438.3-2004 前-F司GB/T 19438-2004(禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分:一-GB/T19438. 1-2004(禽流感病毒通用荧光R丁PCR检测方法沁甲一-GB/T19438. 2-2004(H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法以GB/T 19438.3-2004( H7亚型禽流感病毒荧光RTPCR检测方法); GB/T 19438. 4-2004(H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位z中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基
2、生物工程股份有限公司。本部分主要起草人高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。I 1 范围H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件GB/T 19438.3-2004 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件,其最新版本适用于本部分。GB/T 19438. 1-2004 禽流感病毒
3、通用荧光RT-PCR检测方法3 缩暗语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链式反应。3.2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。3. 3 RNA 核糖核酸。3.4 Taq酶Tq D0JA聚合酶。3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。3.6 DEPC 焦碳酸乙二醋。4 原理采用TaqMan方法,通过比对禽i流感病毒血凝素基因,设计对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探钊的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5端标记FAM荧光素为报告荧光基因(R),3端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5端荧光基
4、团发出的荧光信号,称为洋灭荧光基因。反应在退火时,号|物和探针同时与目的基因片段结合,1 GB/T 19438.3-2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,T叫酶发挥53的外切核酸酶功能,将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料5. 1 试剂除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)进行分装。5. 1. 1 H7亚型禽流感病毒荧光RT.PCR检测试剂盒
5、lV试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A。5. 1. 2 三氯甲烧。5. 1. 3 异丙醇。5. 1. 4 75%乙醇,用新开启的无水乙障和无RNA酶的水配制。5. 1. 5 0.01 mol/L (pH7. 2)的PBS:配方见GR/T19438. 12004中附录A,121 c士2c , 15 min 高压灭菌后,无菌条件下按10000 IU/mL加入青霉素和链霉素。5.2 仪器设备5. 2. 1 高速台式冷冻离心机=要求最大离心力在12000r/min以上。5.2.2 荧光PCR仪。5.2.3 计算机。5.2.4 2C 8 c冰箱。5. 2. 5 - 20 c冰箱。5.2.6 微量
6、加样器:O. 5L 10,1.:5L201.; 20 I. 2001.;200L 1 000L 5.2.7 i.昆匀器。5.2.8 可移动紫外灯:要求近工作台面。6 样品的采集与前处理采样过程中样本间不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6. 1 取样工具需要下列取样工具z棉拭子,剪刀、慑子,Eppendorf管,研钵。以仁取样工具必须经121c士2oC , 15 min高压灭菌并烘干。6.2 采样方法6. 2. 1 活禽样品2 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法为2对于咽喉拭子,采取时要深入喉头及t项裂来回刮3次5次取咽喉分泌液;取泄殖腔拭子时,将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便,1
7、)由指定单位提供,给出这信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。GB/T 19438.3-2004 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中备用。6.2.2 肌肉或脏器样晶用无菌的剪刀、慑子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,加10mL PBS混匀,1000 g离心10min 后,取上清液转入Eppendorf管中备用。6.2.3 血清或血浆用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。6.2.4 保存与运送采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h,长期保存须在70 c以下,
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