GB T 19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法.pdf
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1、GB/T 19438.2-2004 前言GB/T 19438-2004 禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分2一-GB/T19438. 1 2004 (禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法); 一GB/T19438.2 2004 ( H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法们GB/T 19438.3 2004 ( H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法hGB/T 19438.4-2004 ( H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A是资料性附录a本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位z中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市
2、匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人,:XiJ环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。I G/T 19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1 范围本部分规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通
3、用荧光RT-PCR检测方法3 缩略语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。3.2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。3.3 RNA 核糖核酸。3.4 T呵酶Taq DNA聚合酶。3.5 PS 磷酸盐缓冲生理盐水。3. 6 DEPC 焦碳酸乙二醋。4 原理采用TaqMan方法,在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上,设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和条特异性的荧光双标探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5端标记FAM荧光素为报告荧光基因(用R表示),3端标记TAMRA荧光素为洋灭荧光基团(用Q表示),
4、它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测l不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,T叫酶发挥5F3的外切核酸酶功能,将探针降解。这样探针上的GB/T 19438.2-2004 R基因游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复.PCR产物呈指数形式增长,荧光信号也相应增长,实现f荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5 试剂和材料5. 1 试剂除另有说明,所用试剂均为分析纯3所有试剂均用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5. 1.
5、 1 三氯甲炕。5. 1. 2 异丙醇20C预冷。5. 1. 3 75 %乙醇用新开启的元水乙醇和DEPC水配制.-20C预冷。5. 1. 4 0.01 mol/LCpH 7.2)的PBS配方见GB/T19438. 1-2004中附录A,121C土20C, 15 min高压灭菌冷却后,元商条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL, 5. 1. 5 H5 JF:型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒l)试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A,5.2 仪器设备5. 2. 1 高速台式冷冻离心机2最大离心力12000 r/min以上。5.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。5.2.3 2C
6、 -4C冰箱和-20C冰箱。5.2.4 微量加样器,0.5川,-10L.51,-20L.20L200L,200 I,L 1 000L。5.2.5 组织匀浆器。5. 2. 6 1.昆匀器。5.2.7 可移动紫外灯。6 样晶的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6. 1 取样工具下JIJ取样工具必须经121c士2C.15min高压灭菌或经160C士2C干烤2h, 拭子,剪、慑;研钵zEppendorf管(1.5时,)。6.2 采样方法6. 2. 1 活禽样晶取咽喉拭子和泄殖腔拭子,具体采集方法如下:咽喉拭子,采取时要将拭子深入喉头及上腾裂来回刮3次5次,取
7、咽喉分泌液;取泄殖腔拭子时,将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便;将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中,编号备用。6.2.2 内脏或肌肉样晶用无菌慑剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,再加10mL PBS 昆匀,或置于组织匀浆器中,加入10mL PBS匀浆,然后将组织悬液转入元菌Eppendorf管中3000/min离心10min取上清液转2 1 )由指定单位提供,给出这一信息是为了万便本标准的使用者,并平表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。人Eppendorf管中,编号备用。6.2.3 血清或血浆用无菌注射器直接吸
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