SN T 5211-2020 南方红豆杉鉴定方法.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5211 2020 南方红豆杉鉴定方法 Identification of Taxus wallichiana var. mairei （ Lemnulle & H. Lnullveillnull） L. K.Fu & Nan Li 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5211 2020 前 言 本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署

2、提出并归口。 本文件负责起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国 合肥海关。 本文件起草人：张明哲、尹文秀、滕少娜、李刚、张巧琦、张晓峰、吴姗、虞惠贞、陈吴健、 林晓佳、吴志毅。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5211 2020 南方红豆杉鉴定方法 1 范围 本文件规定了南方红豆杉的鉴定方法。 本文件适用于南方红豆杉的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性引用而构成本必不可少条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682

3、分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14072 林木种质资源保存原则与方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1苞片 bract 在花或序基部着生的变态叶，有保护花芽或果实的作用，是有花植物身上的一种特殊过渡器 官。按其在茎轴上的位置、排列和形态的不同，另有小苞片和总苞之别。通常把包被花或花簇的一轮 苞片称为总苞，着生于花序梗上的小的苞片称为小苞片，总苞的形状和轮数为种属鉴别的特征之一。 3.1.2假种皮 aril 由珠被之外的组织发育而来的包被着种子的结构。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 C

4、TAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide）。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。 dNTP ：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）。 Taq 酶：栖热水生菌 DNA 聚合酶。 OD ：光密度值（optical density）。 bp ：碱基对（base pair）。 4南方红豆杉基本信息 学名： Taxus wallichiana var. mairei（Lem nulle & H. Lnullveillnull）L. K. Fu & Nan Li 以正式出版文

5、本为准 2 SN/T 5211 2020 异名：美丽红豆杉，杉公子，赤推，榧子木，海罗松，红叶水杉 英文名：Maire yew 中文名：南方红豆杉 分类地位：裸子植物门（Gymnospermae），松杉纲（Coniferopsida），红豆杉目（Taxales），红豆杉 科（Taxaceae），红豆杉属（ Taxus）。 地理分布：分布于安徽南部、浙江、台湾、福建、江西、广东北部、广西北部及东北部、湖 南、湖北西部、河南西部、陕西南部、甘肃南部、四川、贵州及云南东北部。在多数省区常生于海拔 1000 m1200m 以下的地方。 南方红豆杉为我国特有树种，为国家重点保护野生植物名录（第一批）中的

6、 I 级重点保护野 生植物。 5方法原理 南方红豆杉可能以种子、幼苗、植株等形式出境，本文件将南方红豆杉的种子、叶片等形态特 征及分子特征作为鉴定的主要依据。 6仪器用具和试剂 6.1仪器用具 体视显微镜、电子天平、高压灭菌器、pH 计、恒温水浴锅、研钵、纯水仪、涡旋振荡器、液氮 罐、高速冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、荧光定量 PCR 扩增仪、可调移液器（1000 L，200 L，20 L，10 L，2.5 L）等。 6.2主要试剂 CTAB 缓冲液、酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、RNase A、液氮、实时荧光 PCR 预混液、引 物和探针，除另有规定外，均为分析纯或生化纯，水为按照 GB/T

7、 6682 规定的执行。 7鉴定方法 7.1形态学方法 7.1.1红豆杉科植株形态特征 7.1.1.1 常绿乔木或灌木。 7.1.1.2 叶：叶条形或披针形，螺旋状排列或交叉对生，上面中脉明显、微明显或不明显，下面沿 中脉两侧各有 1 条气孔带，叶内有树脂道或无。 7.1.1.3 花：球花单性，雌雄异株，稀同株；雄球花单生叶腋或苞腋，或组成穗状花序集生于枝顶， 雄蕊多数，各有 3 个 9 个辐射排列或向外一边排列有背腹面区别的花药，药室纵裂，花粉 无气囊；雌球花单生或成对生于叶腋或苞片腋部，有梗或无梗，基部具多数覆瓦状排列或 交叉对生的苞片，胚珠 1 枚，直立，生于花轴顶端或侧生于短轴顶端的苞

8、腋，基部具辐射对 称的盘状或漏斗状珠托。 7.1.1.4 种子：种子核果状，无梗则全部为肉质假种皮所包，如具长梗则种子包于囊状肉质假种皮 中、其顶端尖头露出；或种子坚果状，包于杯状肉质假种皮中，有短梗或近于无梗；胚乳 丰富；子叶 2 枚。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5211 2020 7.1.2红豆杉属植株形态特征 7.1.2.1 常绿乔木或灌木；小枝不规则互生，基部有多数或少数宿存的芽鳞，稀全部脱落；冬芽芽 鳞覆瓦状排列，背部纵脊明显或不明显。 7.1.2.2 叶：叶条形，螺旋状着生，基部扭转排成二列，直或镰状，下延生长，上面中脉隆起，下 面有两条淡灰色、灰绿色或淡黄色的气孔带，叶内

9、无树脂道。 7.1.2.3 花：雌雄异株，球花单生叶腋；雄球花圆球形，有梗，基部具覆瓦状排列的苞片，雄蕊 6枚14 枚，盾状，花药 4 9，辐射排列；雌球花几无梗，基部有多数覆瓦状排列的苞片， 上端2对3 对苞片交叉对生，胚珠直立，单生于总花轴上部侧生短轴之顶端的苞腋，基部 托以圆盘状的珠托，受精后珠托发育成肉质、杯状、红色的假种皮。 7.1.2.4 种子：种子坚果状，当年成熟，生于杯状肉质的假种皮中，稀生于近膜质盘状的种托之上， 种脐明显，成熟时肉质假种皮红色，有短梗或几无梗；子叶 2 枚，发芽时出土。 7.1.3南方红豆杉形态特征 7.1.3.1 乔木，树皮浅灰色或暗褐色，纵裂，呈长薄条片

10、状剥落（参见附录 A 和附录 B）。 7.1.3.2 叶：叶条形，多呈弯镰状，通常长 2cm 3.5cm（4.5cm），宽 3mm4mm（5mm），上部常 渐窄，先端渐尖，下面中脉带上无角质乳头状突起点，或局部有成片或零星分布的角质乳 头状突起点，或与气孔带相邻的中脉带两边有一至数条角质乳头状突起点，中脉带明晰可 见，其色泽与气孔带相异，呈淡黄绿色或绿色，绿色边带亦较宽而明显。 7.1.3.3 花：雌雄异株，球花单生叶腋；雄球花圆球形，有梗，基部具覆瓦状排列的苞片，雄蕊 6枚14 枚，盾状，花药 4 9，辐射排列；雌球花几无梗，基部有多数覆瓦状排列的苞片， 上端2对3 对苞片交叉对生，胚珠直立

11、，单生于总花轴上部侧生短轴之顶端的苞腋，基部 托以圆盘状的珠托，受精后珠托发育成肉质、杯状、红色的假种皮。 7.1.3.4 种子：种子通常较大，微扁，多呈倒卵圆形，上部较宽，稀柱状矩圆形，长 7mm 8mm，径 5mm，有纵楞脊，种脐常呈椭圆形。 7.2分子生物学方法 7.2.1DNA 提取 按 CTAB 方法提取 DNA（参见附录 C），或采用商品化 DNA 提取试剂盒。 7.2.2实时荧光 PCR 鉴定方法 南方红豆杉的实时荧光 PCR 检测方法见附录 C，防污染措施应符合标准 SN/T 1193 的规定。 7.2.3质量控制 阳性对照：Ct 值小于或等于 35 ； 阴性对照：Ct 值大于

12、或等于 40 ； 空白对照：Ct 值大于或等于 40 ； 上述指标有一项不符合者，应重做实时荧光 PCR 扩增。 8结果判定 样品叶和种子等形态学特征与 7.1.3 的描述相符，且实时荧光 PCR 鉴定样品 Ct 值小于或等于 35， 则判定该样品为南方红豆杉。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5211 2020 9样品保存与复核 9.1样品保存 物种资源的样品保存方法见标准 GB/T 14072。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的名称与编号、来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结 果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有分类鉴别的特征照片，分子生物学检测

13、需有 最终的实验数据。原始数据应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 9.3复核 复核工作由海关总署指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实 性，必要时由专家对检测结果进行复核。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5211 2020 附 录 A （资料性附录） 我国红豆杉科分属检索表 （1）叶上面中脉不明显或微明显，叶内有树脂道；雄球花单生叶腋，雄蕊的花药向外一边排列有背 腹面区别；雌球花两个成对生于叶腋，无梗；种子全部包于肉质假种皮中。 榧树属 Torreya Arn. （1）叶上面有明显的中脉；雌球花单生叶腋或苞腋；种子生于杯状或囊状假种皮中，上部或顶端 尖头露出

14、。 （2） （2）叶交叉对生，叶内有树脂道；雄球花多数，组成穗状花序，2 6 序集生于枝顶，雄蕊的花药 辐射排列或向外一边排列有背腹面区别；雌球花生于新枝上的苞腋或叶腋，有长梗；种子包于囊状肉 质假种皮中，仅顶端尖头露出。 穗花杉属 Amentotaxus Pilger （2）叶螺旋状着生，叶内无树脂道；雄球花单生叶腋，不组成穗状球花序，雄蕊的花药辐射排列； 雌球花单生叶腋，有短梗或几无梗；种子生于杯状假种皮中，上部露出。 （3） （3）小枝不规则互生；叶下面有两条淡黄色或淡灰绿色的气孔带；种子成熟时肉质假种皮红色。 红豆杉属 Taxus Linn. （3）小枝近对生或近轮生；叶下面有两条白粉

15、气孔带，种子成熟时肉质假种皮白色。 白豆杉属 Pseudotaxus W.C.Cheng 我国红豆杉属分种检索表 （1）叶排列较密，不规则两列，常呈y形开展，条形，通常较直或微呈镰状，上下几等宽， 先端急尖，基部两侧对称或微歪斜；小枝基部常有宿存芽鳞。 （2） （1）叶排列较疏，排成二列，常呈条形、披针形或条状披针形，多呈镰形，稀较直，上部通常渐 窄或微渐窄，先端渐尖或微急尖，基部两侧歪斜；芽鳞脱落或部分宿存于小枝基部。 （3） （2）叶排列成彼此重叠的不规则两列，通常直，基部两侧常相对称，下面中脉带上密生均匀细小 的圆形角质的乳头状突起点；种子柱状矩圆形，上下等宽或上部较宽，上部两侧微有钝脊

16、，种脐椭圆 形（西藏南部）。 密叶红豆杉 T. fuana Nan Li & R. R. Mill （2）叶排列成不规则两列，微呈镰状，基部两侧微歪斜或近对称，下面中脉带上无角质的乳头状 突起点；种子卵圆形或三角状卵圆形，通常上部具 3 4 条钝纵棱脊，种脐常呈三角状或四方形，间 或微扁，稀近圆形或椭圆形，上部具两条钝脊（吉林、辽宁；山东、江苏、江西有栽培）。 东北红豆杉 T. cuspidata S. et Z. （3）叶质地薄，披针状条形或条状披针形，常呈弯镰状，中上部渐窄，先端渐尖，干后边缘向 下卷曲或微卷曲，下面中脉带上有密生均匀而微小的圆形角质乳头状突起点，长 1.5cm 4.7cm

17、（多为 2.5cm3cm），宽 2mm3mm，干后通常色泽变深（云南西北部及西部、四川西南部、西藏东南部）。 喜马拉雅红豆杉 T. wallichiana Zucc. （3）叶质地稍厚，边缘不卷曲或微卷曲。 （4） （4）叶较短，条形，微呈镰状或较直，通常长 1.5cm 3.2cm，宽 2mm4mm，上部微渐窄，先端 具微急尖或急尖头，边缘微卷曲或不卷曲，下面中脉带上密生均匀而微小圆形角质乳头状突起点，其 色泽常与气孔带相同；种子多呈卵圆形，稀倒卵圆形（甘肃、陕西、四川、云南、贵州、湖北、湖 南、广西、安徽）。 红豆杉 T. wallichiana var. Chinensis（ Pilger

18、） Florin （4）叶较宽长，披针状条形或条形，常呈弯镰状，通常长 2cm 3.5cm，宽 3mm4.5mm，上部渐 窄或微窄，先端通常渐尖，边缘不卷曲，下面中脉带的色泽与气孔带不同，其上无角质乳头状突起 点，或与气孔带相邻的中脉带两边有 1 至数行或成片状分布的角质乳头状突起点；种子多呈倒卵圆 形，稀柱状矩圆形（安徽、浙江、台湾、福建、江西、广东、广西、湖南、湖北、河南、陕西、甘 肃、四川、贵州、云南）。 南方红豆杉 T. wallichiana var. mairei 以正式出版文本为准 6 SN/T 5211 2020 附 录 B （资料性附录） 南方红豆杉形态特征图 图 B.1树冠

19、 图 B.3叶 图 B.2树皮 图 B.4雄球花 以正式出版文本为准 7 SN/T 5211 2020 注：图 B.1 引自 图 B.2 引自 图 B.3 引自 图 B.4 引自 图 B.5 引自 图 B.6 引自 图 B.5假种皮 图 B.6种子 以正式出版文本为准 8 SN/T 5211 2020 附 录 C （资料性附录） 实时荧光 PCR 鉴定方法 C.1DNA 提取 C.1.1将样品用球磨仪或研钵液氮冷冻后磨碎，称取 50 mg 100 mg 于 1.5 mL 的灭菌离心管中， 加入 700 L CTAB 缓冲液，振荡混匀，置于 65 温浴 60 min 90 min，期间不断混匀；

20、冷却后加入 5 LRNA 酶溶液，置 37 温浴 30 min ； C.1.2加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 ： 24 ： 1），振荡均匀，12000 r/min，离心 15 min ； C.1.3取上清液放入另一 1.5 mL 新管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒 3 次 5 次，置 -20 冰箱中放置 40 min ； C.1.412000 r/min 离心 10 min，弃去上清液； C.1.5加入 400 L 70乙醇溶液洗涤，12000 r/min 离心 1 min，弃上清液，将离心管室温下干 燥 15 min ； C.1.6加入 50 L100 L TE 或无菌去离子水，置 6

21、5 水浴 40 min 充分溶解 DNA，测量 DNA 的浓度和纯度后置于 -20 冰箱保存备用。 注：也可使用试剂盒进行 DNA 提取，具体方法按照试剂盒说明书操作。 C.2DNA 纯度与浓度的测定 用核酸蛋白分析仪测定 DNA 的纯度与浓度，分别取得 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，计算核酸 的纯度和浓度，计算公式见式（C.1）和（C.2）： DNA 纯度 =OD 260 /OD 280 （C.1） DNA 浓度 =50OD 260 g/mL （C.2） PCR 级 DNA 溶液的 OD 260 /OD 280 比值应为 1.72.0。 C.3实时荧光 PCR 检测 C.3.1

22、引物探针序列 南方红豆杉实时荧光 PCR 方法鉴定引物探针序列见表 C.1。 表 C.1 引物序列 引物和探针 序列 TM-F 5-GATTGCACCAAGGATCTG-3 TM-R 5-CGCTACATTCTTCATCGT-3 TM-P 5-ATAGCTGTGCGTGCTGCGCG-3 注：探针 5端标记 FAM 报告荧光染料，3端标记 BHQ1 淬灭荧光染料。 以正式出版文本为准 C.3.2检测体系 检测体系见表 C.2。 表 C.2检测体系 试剂名称 加入 PCR 反应体系的体积 / L 实时荧光 PCR 预混液（2） 10 正向引物（10 M） 0.4 反向引物（10 M） 0.4 探

23、针（10 M） 0.2 DNA 模板（1030 ng/ L） 2 灭菌双蒸水 7 总计 20 依次将上述试剂按照表 C.2 体系浓度要求加入 PCR 反应管，混合均匀后放入定量 PCR 仪，每个 反应体系设置两个平行反应。以南方红豆杉叶片 DNA 为阳性对照，非南方红豆杉叶片 DNA 为阴性对 照，灭菌双蒸水为空白对照。 C.3.3反应条件 95 30s ；95 15s，64 34s，共 40 个循环。 以正式出版文本为准 SN/T 5211 2020 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 28 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175150 定价 18.00 元 南方红豆杉鉴定方法 行 业 标 准 SN/T 52112020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址