DB15 T 1900—2020 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程.pdf

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1、ICS 65.020.30 B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1900 2020 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤 模型构建技术规程 Technical regulations for establishment of hydrogen peroxide-induced oxidative damage model of bovine mammary epithelial cells 2020-06-10发布 2020-07-10实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1900 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-200

2、9给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业 标准化技术委员会（ SAM/TC 19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人员：马燕芬、赵磊、吴志红、宋利文、凤英、张春华、乃门塔娜、羿静、宝华、 杜瑞平、高民、米丽。 DB15/T 1900 2020 1 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程 1 范围 本标准规定了过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建方法。 本标准适用于采用过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞产生氧化损伤模型的构建。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 原代细胞培养 pr

3、imary cell culture 将乳腺上皮细 胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法。 3 工作区条件 工作区由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。 4 主要仪器、设备及耗材 4.1 主要仪器、设备 超净工作台、 CO2培养箱、倒置显微镜、 4 离心机、 4 冰箱、 -20 冰箱、 0.22 m过滤器 、 80目滤网。 4.2 主要耗材 25 cm2细胞培养瓶、 90 mm细胞培养皿、 15 mL离心管、 300 mL烧杯、 250 mL蓝口瓶、 1.5 mL Eppendof 管、 2 mL冻存管、 6孔板、 24孔板、 96孔板、 10 L-5 m

4、L移液枪及枪头、 瓷盘 、 镊子 、 剪刀 、 贮液瓶 。 5 主要试剂及配制 5.1 主要试剂 DMEM/F12培养基 、 10 %胎牛血清 、 双抗 、 5 %胰岛素转铁蛋白硒钠 、 氢化可的松 、 两性霉素 B、 表皮 生长因子 、 催乳素 、 L-谷氨酰胺 、 PBS缓冲液 （ pH7.4）、 0.5 % 型胶原酶、 10 %二甲基亚砜（ DMSO）、 30 %过氧化氢、甲醇、高压灭菌超纯水、 0.4 %台盼蓝、 75 %酒精 、 新洁尔灭 、 0.25 %胰酶 、 丙酮 、 10 % 山羊血清、 兔抗细胞角蛋白（ cytokeratin） 18单克隆抗体 、山羊抗兔免疫球蛋白 G、

5、Alexa Fluor488、 DAPI染液、 四氮唑蓝盐化合物（ MTS） 、细胞裂解液、 活性氧（ ROS）试剂盒 、 丙二醛（ MDA）试剂盒 、 DB15/T 1900 2020 2 超氧化物歧化酶（ SOD）试剂盒 、 谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-Px）试剂盒 、 过氧化氢酶（ CAT）试剂盒 、 谷胱甘肽巯基转移酶（ GST）试剂盒 、 乳酸脱氢酶（ LDH）试剂盒 。 5.2 培养基配制 5.2.1 完全培养基（生长培养基 ， 按配 100 mL计算） 将 10 %胎牛血清 10 mL、双抗 1 mL、 5 %胰岛素转铁蛋白硒钠 0.5 mL、 100 g/mL氢化可的松 10

6、0 L、 100 g/mL两 性霉素 B 100 L、 10 ng/mL表皮生长因子 10 L、 50 g/mL催乳素 50 L、 200 mmol/L L- 谷氨酰胺 1.5 mL加入 86.74 mL的 DMEM/F12培养基中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， 4 保存。 5.2.2 无血清培养基（饥饿培养基 ， 按配 100 mL计算） 将双抗 1 mL、 5 %胰岛素转铁蛋白硒钠 0.5 mL、 100 g/mL氢化可的松 100 L、 100 g/mL两性霉 素 B 100 L、 10 ng/mL表皮生长因子 10 L、 50 g/mL催乳素 50 L、 200 mmol/L

7、 L-谷氨酰胺 1.5 mL 加入 96.74 mL的 DMEM/F12培养基中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， 4 保存。 5.2.3 终止培养基（按配 100 mL计算） 将 10 %胎牛血清 10 mL加入 90 mL DMEM/F12培养基中 ， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， 4 保存。 5.3 试剂配制 5.3.1 氢化可的松 （ 100 g/mL） 将 100 g氢化可的松溶于 1 mL无水乙醇中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装 ， -20 保存。 5.3.2 两性霉素 B（ 100 g/mL） 将 1 mg两性霉素溶于 10 mL无菌超纯水中， 0.22 m

8、滤器过滤 ， 密封分装， -20 保存。 5.3.3 表皮生长因子 （ 10 ng/mL） 将 0.2 mg表皮生长因子溶于 20 mL DMEM/F12培养基 中，充分混匀，配制成 10 g/mL的表皮生长因 子浓贮 ， 取 100 L 10 g/mL浓贮 溶于 100 mL DMEM/F12培养基 中 ，即为 10 ng/mL表皮生长因子工作液 ， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， -20 保存。 5.3.4 催乳素 （ 50 g/mL） 将 250 IU的催乳素（按 25 IU/mg转换）溶于 1 mL DMEM/F12培养基 中，配制成浓度为 10 mg/mL的浓 贮，取 100

9、L 10 mg/mL浓贮 溶于 20 mL DMEM/F12培养基 中 ，即为 50 g/mL催乳素工作液 ， 0.22 m 滤器过滤 ， 密封分装， -20 保存。 5.3.5 L-谷氨酰胺 （ 200 mmol/L） 称取 2.923 g谷氨酰胺溶于 100 mL DMEM/F12培养基 中 ，即为 200 mmol/L的谷氨酰胺， 0.22 m滤器 过滤 ， 密封分装， -20 保存。 5.3.6 含 1 %双抗的 PBS 将 5 mL双抗加入 500 mL PBS中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， 4 保存。 DB15/T 1900 2020 3 5.3.7 含 3 %双抗的

10、PBS 将 15 mL双抗加入 500 mL PBS中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， 4 保存。 5.3.8 型 胶原酶 （ 0.5 %） 称取 100 mg 0.5 % 型 胶原酶 粉末溶于 20 mL PBS中， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装 ， -20 保存。 5.3.9 细胞冻存液（ 100 mL） 将 20 mL 10 %胎牛血清 和 10 mL 10 %二甲基亚砜加入到 70 mL完全培养基中 ， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装 ， 4 保存。 5.3.10 过氧化氢甲醇 （ 3 %） 将 30 %过氧化氢和甲醇按 1： 9的比例稀释， 0.22 m滤器过滤 ，

11、 密封分装 ， -20 避光保存，现用 现配。 5.3.11 过氧化氢原液配制（ 1 mol/L） 在 1 mL H2O2中加入 8 mL高压灭菌超纯水稀释到 9 mL，配制成浓度为 1 mol/L（ 1000mmol/L）的 H2O2 原液， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装 ， 4 保存。 注： 30 % H2O2浓度约为 9 mol/L。 5.3.12 过氧化氢工作液配制（ 600 mol/L） 在 0.006 mL 1000 mmol/L 的 H2O2原液 中加入 9.994 mL高压灭菌超纯水稀释到 10 mL，即为 600 mol/L H2O2工作液 ， 0.22 m滤器过滤 ，

12、 -20 保存， 每次换液时现配。 5.3.13 过氧化氢诱导培养基配制（ 600 mol/L，按 20 mL计） 将 12 L的 1000 mmol/L的 H2O2原液加入到 19.98 mL的无血清培养基中，即为 600 mol/L H2O2诱导培 养基， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装 ， -20 保存， 每次换液时现配。 5.3.14 一抗 将兔抗细胞角蛋白（ cytokeratin） 18单克隆抗体与 PBS按 1： 200比例稀释而成， 0.22 m滤器过滤 ， 密封分装， -20 保存 。 5.3.15 二抗 采用 Alexa Fluor488标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G，

13、-20 保存 。 6 奶牛乳腺上皮细胞体外培养 6.1 奶牛乳腺样品采集 商业屠宰场采集健康奶牛乳腺组织，选取切开后乳腺深层组织内无出血点，切面呈肉白色，能见白 色乳汁的健康奶牛乳腺组织约 200 g，立即装入干净样品袋中带回实验室。 DB15/T 1900 2020 4 6.2 奶牛乳腺样品处理 6.2.1 在操作台前点燃 酒精灯，取 250 mL 贮液瓶，装入约 200 mL 含 3 %双抗的 PBS 溶液 。 6.2.2 将采集的乳腺样品放入已 灭过菌 的瓷盘里，用镊子和剪刀剪掉组织外层，于深层处选取 1 cm3 大小的组织块 若干块（注意避开导管和结缔组织） 。 6.2.3 放入贮液瓶

14、中浸泡 10 min。 6.3 奶牛乳腺上皮细胞原代培养 6.3.1 准备好需要拿到培养间的物品：含 1 %双抗的 PBS，含 3 %双抗的 PBS， 75 %酒精， DMEM/F12 培 养基， 0.5 %型胶原酶， 15 mL 离心管， 90 mm 细胞培养皿， 25 cm2细胞培养瓶。 6.3.2 关闭超净台紫外照射灯，打开超净台并点燃酒精灯。 6.3.3 将浸泡后的乳腺组织移至超净台内，依次用含 3 %双抗的 PBS 清洗三遍， 75 %酒精浸泡 30 s， 含 1 %双抗的 PBS 清洗三遍，然后将乳腺组织放入一无菌 90 mm 细胞培养皿中，用眼科镊子和剪刀剪去 组织块表层，剪取深

15、层腺泡约 1 mm3的乳腺组织放入另一无菌 90 mm 细胞培养皿中，用眼科剪刀将乳腺 组织块剪成糊状。 6.3.4 将呈糊状的乳腺组织块吸移至 15 mL 离心管中，用适量含 1 %双抗的 PBS 清洗 90 mm 细胞培养 皿 3 次，液体转入 15 mL 离心管中， 1300 r/min 离心 5 min。 6.3.5 弃掉上清液，向离心管中加入等体积的 0.5 %型胶原酶。 6.3.6 盖好离心管盖子，放入 37 水浴锅消化 1 h，消化过程中每隔 20 min 轻轻摇晃离心管。 6.3.7 消化完毕后，将消化后的组织块用 80 目滤网过滤（滤网应先用含 1 %双抗的 PBS 润湿）到

16、灭菌 烧杯里，用含 1 %双抗的 PBS 将 离心管润洗 3 遍后，经滤网过滤到烧杯里。 6.3.8 用 5 mL 枪头吸取滤液于 15 mL 离心管（根据滤液的多少来决定个数）内，用含 1 %双抗的 PBS 清洗烧杯后， 将液体也转移到离心管中， 1300 r/min 离心 5 min。 6.3.9 弃掉上清液，分别向 15 mL 离心管中加入含 1 %双抗的 PBS 3 mL 清洗，轻轻吹打后， 1300 r/min 离心 3 min。 6.3.10 再次弃掉上清液，向其加入 5 mL 完全培养基，轻轻充分混匀后，将 5 mL 细胞培养液全部吸出， 轻轻放置于 25 cm2细胞培养瓶中，于

17、 37 ， 5 % CO2培养箱中培养。 6.3.11 收拾超净台，喷洒新洁尔灭。 6.4 奶牛乳腺上皮细胞传代及纯化 6.4.1 待细胞生长至 70 % 80 %汇合度，从 CO2培养箱中取出培养瓶，在超净台内吸去旧培养基。 6.4.2 加入 PBS 清洗 2 次，弃掉上清液。 6.4.3 加入 0.25 %胰酶 1 mL（注意让枪头从培养瓶侧面加入，不要对着细胞加），计时 30 s，弃掉 上清液，加入 PBS 清洗 2 次，弃掉上清液。 6.4.4 加入 0.25 %胰酶 1 mL，于 37 ， 5 % CO2培养箱中消化培养 9 min。 6.4.5 取出培养瓶，于倒置显微镜下观察细胞脱

18、壁情况。 6.4.6 乳腺上皮细胞消化完全后，迅速向瓶内加入 3 mL 终止培养基终止消化，防止深度消化损伤细胞， 用 1 mL 枪头将细胞培养瓶底壁的细胞吹打下来。 6.4.7 吸取细胞悬液于 15 mL 离心管中，室温 1000 r/min 离心 5 min。 6.4.8 弃掉上清液，向 15 mL 离心管中加入 3 mL PBS 清洗，轻轻吹打后，室温 1000 r/min 离心 5 min。 6.4.9 再次弃掉上清液，向其加入 5 mL 完全培养基，将细胞沉淀充分吹散开后，细胞计数，以 2.010 5 个 /mL 的密度接种于 25 cm2细胞 培养瓶中。 6.4.10 全部吸出轻轻

19、加入到 25 cm2细胞培养瓶中，于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养。 DB15/T 1900 2020 5 6.5 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线绘制 6.5.1 制备细胞悬液 将生长良好的第三代细胞消化下来，计数后分别制成 0.510 4个 /mL、 1.010 4个 /mL、 2.010 4个 /mL细胞悬液 25 mL，备用。 6.5.2 接板 吸取 0.510 4个 /mL、 1.010 4个 /mL、 2.010 4个 /mL细胞悬液于不同 24孔板内，每个浓度 24个孔， 每孔 1 mL，于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 24 h。 6.5.3 计数 培养 24 h后，用

20、 0.25 %胰酶消化 24孔板中 0.510 4个 /mL、 110 4个 /mL、 210 4个 /mL的 3孔细胞， 分别制成 1 mL细胞悬液并计数。以后每隔 24 h计数一次，连续 8 d，未计数细胞组每 2 d换液一次。 6.5.4 绘图 以培养天数为横坐标，乳腺上皮细胞浓度为纵坐标，绘制折线图。 6.6 奶牛乳腺上皮细胞活力测定 6.6.1 染色：将细胞制成细胞悬液，用 10 L 移液枪分别吸取 10 L 细胞悬液和 10 L 0.4 %台盼蓝， 并将其混匀。 6.6.2 计数：混匀后静置 30 s，吸取 20 L 混合液于细胞计数板上，使混合液充满盖片和计数板之间， 在倒置显微

21、镜下 100计数， 无色且透明 发亮 的小圆圈为健康活细胞，蓝色细胞为死细胞。 6.6.3 存活率：计数 1000 个细胞中被台盼蓝染成蓝色的细胞个数，细胞存活率等于存活细胞个数与细 胞总数量的比率。 6.7 奶牛乳腺上皮细胞免疫荧光染 色测定 6.7.1 纯化的奶牛乳腺上皮细胞以 2104个 /mL 接种到 24 孔板中，待长至半汇合单层状态时进行下一 步实验。 6.7.2 用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次， 2 min/次，用冰浴的丙酮：甲醇（ 1： 1）固定细胞 20 min。 6.7.3 用 PBS 缓冲液冲洗细胞 3 次， 5 min/次，滴加 1 mL 3 %过氧化 氢甲醇

22、溶液室温静置 10 min，以 阻断内源性过氧化氢酶。 6.7.4 再用 PBS 缓冲液冲洗细胞 3 次， 5 min/次，滴加 1 mL 10 %山羊血清室温静置或封闭 1.5 h。 6.7.5 去掉血清，滴加 1 mL 一抗，于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 2 h。 6.7.6 用 PBS 缓冲液清洗 3 次， 5 min/次，在避光条件下，滴加 1 mL 二抗，于 37 ， 5 % CO2培养 箱中室温避光培养 1 h。 6.7.7 用 PBS 缓冲液清洗 3 次， 5 min/次，在避光条件下 DAPI 复染细胞核 5 min。 6.7.8 再 用 PBS 缓冲液冲洗 3 次

23、， 5 min/次，荧光倒置显微镜下，观察拍照。 7 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建 DB15/T 1900 2020 6 7.1 奶牛乳腺上皮细胞培养 将传第三代奶牛乳腺上皮细胞使用完全培养基悬浮，并以 210 5个 /mL或 210 4个 /mL密度分别接种 于 25 cm2细胞培养瓶 或 6孔板中，置于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养至细胞贴壁达 80 % 90 %时，于无血 清培养基 中 饥饿培养 12 h 16 h。 7.2 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建 饥饿培养 12 h 16 h后， PBS清洗 2次， 分别 加入 5 mL/瓶或 2.5 m

24、L/孔 的 600 mol/L浓度的 H2O2诱导 培养基，置于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 6 h后，收集细胞培养液。 8 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的判定 8.1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞数量和形态 在倒置显微镜下观察，当奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤数量达 20 % 40 %，氧化损伤乳腺上皮细胞形 态呈现不规则椭圆形态。 8.2 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞增殖率测定及判定 8.2.1 制备细胞悬液 将乳腺上皮细胞制成细胞悬液，浓度为 210 4个 /mL。 8.2.2 接板 向离心管中加入完全培养基，充分混匀，接到 96孔板中，每组 5个复孔，每孔 200 L，于 37

25、 ， 5 % CO2培养箱中继续培养 12 h。 8.2.3 饥饿处理 培养 12 h后 ，每孔内的完全培养基换成 200 L的饥饿培养基，于 37 ， 5 % CO2培养箱培养 16 h。 8.2.4 换液 培养 16 h后，每孔内的饥饿培养基换成 100 L的 H2O2诱导培养基，于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 6 h。 8.2.5 加 MTS 培养 6 h后，在每孔内加 20 L MTS，在 37 ， 5 % CO2培养箱中 培养 1 h 4 h。 8.2.6 测吸光度值 将 96孔板放入酶标仪中中速摇动 10 min， 490 nm读取吸光度（ OD）值， OD值范围为 0.

26、20 0.25。 8.2.7 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞增殖率判定 奶牛乳腺上皮细胞增殖率小于 80 %。 8.3 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化 -抗氧化指标测定及判定 DB15/T 1900 2020 7 8.3.1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化 -抗氧化指标测定 600 mol/L的 H2O2作用于乳腺上皮细胞 6 h后 ，弃上清， 抽取 1 mL PBS清洗每孔内贴壁生长的乳腺 上皮细胞 2次，弃去上清液，每孔加入 200 L的细胞裂解液，冰浴 30 min，将贴壁细胞用细胞刮刀全部 刮下，分别将细胞悬液收集于 1.5 mL Eppendof管中，于 4 ， 12000 r/min离心 10 min，收集上清液测 定氧化和抗氧化指标。 8.3.2 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化 -抗氧化指标判定 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化 -抗氧化指标判定参见表 1。 表 1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化 -抗氧化指标判定范围 氧化指标 判定 范围 ROS 3500 pg/mL MDA 75 mmol/L 抗氧化指标 判定 范围 SOD 150 U/mL GSH-Px 600 U/L CAT 1000 mIU/L LDH 23 IU/L _