GB 4789.41-2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》.pdf

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1、中华人民共和国国家标准GB4789.412016食品安全国家标准食品微生物学检验 肠杆菌科检验2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB4789.4120161 食品安全国家标准食品微生物学检验 肠杆菌科检验1 范围本标准规定了食品中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。2 术语和定义2.1肠杆菌科 Enterobacteriaceae在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.

2、2肠杆菌科计数 EnumerationofEnterobacteriaceae按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。2.3最可能数 mostprobablenumber;MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱:361。3.2 冰箱:25。3.3 水浴箱:461。3.4 天平:感量0.1g。3.5 显微镜:10倍100倍。3.6 均质器。3.7 振荡器。3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150m

3、L、500mL。3.10 无菌培养皿:直径90mm。3.11 无菌试管:18mm180mm、15mm150mm。3.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。4 培养基和试剂4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。GB4789.4120162 4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤):见B.2。4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。4.4 营养琼脂(NA):见B.4。4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。4.6 革兰氏染色液:见B.6。4.7 氧化酶试剂:见B.7。4.8 无菌1mol/LNaOH:见B.8。4.9 无菌1mol/LHCl:见B.9。第一法 肠杆菌科平板计数法5

4、 检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。图1 肠杆菌科平板计数法检验程序GB4789.4120163 6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中,8000r/min10000r/min均质1min2min,或放入盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min2min,制成110的样品匀液。6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成110的样品匀液。6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1mL,沿

5、管壁缓缓注入盛有9mLBPW的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1100的样品匀液。6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。6.2 倾注平板和培养6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW加入两个无菌平皿内作为空白对照。6.2.2 将10mL15mL冷却至46的V

6、RBGA(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。6.2.4 待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,361培养18h24h。6.3 典型菌落计数和确认6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状

7、菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。6.3.5 典型菌落的确认:a) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,361培养18h24h,挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。b) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.31.

8、0)m(1.06.0)m。c) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂GB4789.4120164 的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,判为阳性反应。d) 葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于361培养24h2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。6.4 结果的计算6.4.1 一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见A.1、A.2、A.3、A.4。N=a(n1+0.1n2)d(1)式中:N样品中肠杆菌科菌落数;a确证的肠杆菌科菌落数之和;n1第一稀释度(

9、低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);n2第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);d稀释因子(第一稀释度)。其中,a按式(2)计算:a=bAC(2)式中:a确证的肠杆菌科菌落数;b某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,bA;A某一平板中用于确认试验的菌落数;C某一平板中典型菌落总数。6.4.2 低菌落数若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落,则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算

10、。6.4.3 特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,示例见A.5。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7 报告7.1 菌落数小于100时,以整数报告。7.2 菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,采用两位有效数字。7.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。GB4789.4120165 7.4

11、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.6 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。第二法 肠杆菌科MPN计数法8 检验程序肠杆菌科MPN计数法检验程序见图2。图2 肠杆菌科MPN计数法检验程序GB4789.4120166 9 操作步骤9.1 样品的稀释按6.1进行。9.2 接种和培养9.2.1 非选择性前增菌根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度3管,共9管BPW于361培养18h2h。9.2.2 选择性增菌从BPW各培养管中,分别移取1mL培养物,接种于

12、10mL的EE肉汤中,361培养24h2h。9.2.3 分离用接种环从EE各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于VRBGA平板,361培养24h2h,观察平板上有无典型菌落。9.3 典型菌落的确认典型菌落确认见6.3。10 报告肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌科,其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性,依据EE阳性管数查MPN表(见附录C),报告每克(毫升)样品中肠杆菌科的MPN值。称重取样以MPN/g为单位报告,体积取样以MPN/mL为单位报告。GB4789.4120167 附 录 A结果计算示例A.1 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,

13、并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表A.1。表A.1 肠杆菌科平板计数结果示例1稀释度1100(第一稀释度)11000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261452024用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU4543a4/5126=1015/5145=1454/520=163/524=14N=101+145+16+142+(0.12)10-2=2760.022=12545上述数据按7.2数字修约后,表示为13000或1.3104。A.2 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的

14、平板不作为计数平板,数据见表A.2。表A.2 肠杆菌科平板计数结果示例2稀释度1100(第一稀释度)11000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261182010用于确认试验的菌落数/CFU585确证的菌落数/CFU454a4/5126=1015/8118=744/520=16N=101+74+162+(0.11)10-2=1910.021=9095上述数据按7.2数字修约后,表示为9100或9.1103。A.3 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.3。表A.3 肠杆菌科平板计数结果示例3稀释度1100(第一稀释度)

15、11000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261182020用于确认试验的菌落数/CFU5655确证的菌落数/CFU4640a4/5126=1016/6118=1184/520=160N=101+118+16+02+(0.11)10-2=2350.021=11190上述数据按7.2数字修约后,表示为11000或1.1104。GB4789.4120168 A.4 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。A.5 第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CF

16、U150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,数据见表A.5。表A.5 肠杆菌科平板计数结果示例5稀释度1100(第一稀释度)11000(第二稀释度)典型菌落数/CFU2201982317用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU4300a4/5220=1763/5198=11900N=176+1192 102=14750GB4789.4120169 附 录 B培养基和试剂B.1 缓冲蛋白胨水(BPW)B.1.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠3.5g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000.0mLB.1.2 制法将B.1.1成分加热溶解,于25时调节pH至7

17、.20.2,分装于500mL广口瓶中,每瓶225mL,121高压灭菌15min。B.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤)B.2.1 成分蛋白胨10.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钠(无水)6.45g磷酸二氢钾2.0g牛胆盐20.0g煌绿0.0135g蒸馏水1000.0mLB.2.2 制法将B.2.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,加热不宜超过30min,迅速冷却培养基,于25调节pH至7.20.2,分装于灭菌的18mm180mm试管中,每管10mL,不需高压灭菌,53可存放一个月。B.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)B.3.1 成分蛋白胨7.0g酵母浸膏3.0g3号胆盐1.5g葡萄

18、糖10.0g氯化钠5.0gGB4789.41201610 中性红0.03g(或0.6%酒精溶液5mL)结晶紫0.002g(或0.1%水溶液2mL)琼脂粉10.0g12.0g蒸馏水1000.0mLB.3.2 制法将B.3.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,25时调节pH至7.40.2,分装于灭菌的锥形烧瓶中,不需高压灭菌,用前制备。倾注平板,使用前干燥平板。未干燥的平板53可存放两周。B.4 营养琼脂(NA)B.4.1 成分牛肉浸膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂粉10.0g12.0g蒸馏水1000.0mLB.4.2 制法将B.4.1成分溶于水中,加热煮沸,25时调节pH至7.30.2,121高压灭

19、菌15min。倾注平板,使用前干燥平板。未干燥的平板于53可存放两周。B.5 葡萄糖琼脂B.5.1 成分胰蛋白胨10.0g酵母浸膏1.5g葡萄糖10.0g氯化钠5.0g溴甲酚紫0.015g(或0.4%溴甲酚紫酒精溶液3.75mL)琼脂粉10.0g12.0g蒸馏水1000.0mLB.5.2 制法将B.5.1成分溶于水中,加热煮沸,25时调节pH至7.00.2,分装于15mm150mm试管,每管约5mL,121高压灭菌15min后,试管垂直放置。于53可存放1周。为去除培养基中的氧气,使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中15min,然后迅速冷却,备用。B.6 革兰氏染色液B.6.1 结晶紫染色液B

20、.6.1.1 成分结晶紫1.0gGB4789.41201611 95%乙醇20.0mL1%草酸铵水溶液80.0mLB.6.1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。B.6.2 革兰氏碘液B.6.2.1 成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLB.6.2.2 制法将碘和碘化钾先行混合,加入少许蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。B.6.3 沙黄复染液B.6.3.1 成分沙黄0.25g95%乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLB.6.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。B.6.4 染色方法B.6.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,

21、染1min,水洗。B.6.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。B.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15s30s,直至染色液被洗掉,但不要过分脱色、水洗。B.6.4.4 加沙黄复染液,复染1min,水洗、干燥、镜检。B.6.4.5 革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。B.7 氧化酶试剂B.7.1 成分N,N,N,N-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g蒸馏水100.0mLB.7.2 制法将B.7.1成分溶解于冷水中,少量新鲜配制。B.7.3 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在10s内呈现粉红GB4789.41201612 或紫红色,即为氧化酶试验阳

22、性。不变色者为氧化酶试验阴性。B.8 无菌1mol/LNaOHB.8.1 成分NaOH40.0g蒸馏水1000.0mLB.8.2 制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121高压灭菌15min。B.9 无菌1mol/LHClB.9.1 成分HCl90.0mL蒸馏水1000.0mLB.9.2 制法移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121高压灭菌15min。GB4789.41201613 附 录 C肠杆菌科最可能数(MPN)检索表每克(毫升)检样中肠杆菌科最可能数(MPN)的检索见表C.1。表C.1 肠杆菌科最可能数(MPN)的检索表阳性管数0.100.010.001MPN95%置信区间下限上限阳性管数0.100.010.001MPN95%置信区间下限上限0001100420注1:本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL),每个稀释度接种3管。注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。