GB T 21786-2008 化学品.细菌回复突变试验方法.pdf

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1、ICS 13. 300; 11. 100 A 80 中华人民圭K./、GB 和国国家标准GB/T 21786-2008 化学品细菌回复突变试验方法Chemicals-Test method of bacterial reverse mutation 2008-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2008-09-01实施发布GB/ T 21786一2008剧昌本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.471(1997年)(英文版。本标准作了以下编辑性修改:一一增加了范围部分;-一计量单位改成我国法定计量单位s一一删除了OECD的参考文

2、献部分.本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口.本标准负责起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准参加起草单位=北京市疾病预防控制中心、宁波出入境检验检疫局.本标准主要起草人t邓瑛、穆啸群、吴维皑、赵超英、龙再浩.I GBjT 21786-2008 OECD引言1.细菌回复突变试验应用需要氨基酸的鼠伤寒抄门氏菌(SalmonellaTy Phimurium)和大肠杆菌CEscherichia coli)菌株去检测由DNA的一个或数个碱基对的置换、增加或缺失造成的点突变。本试验的原理是检测试验株中存在的回复突变井恢复合成必需氨基酸的能力。发生

3、回复突变的细菌能在缺乏特定必需氨基酸的条件下生长，而亲代菌株则不能生长，故能检出。当营养缺陷型菌株在受试样品作用下发生回复突变后，即恢复了合成特定氨基酸的能力，因此可以在不含该氨基酸的培养基上形成菌落，而那些没有发生突变的菌株和突变菌株的亲代菌株则因无法合成特定氨基酸而不能在不含该氨基酸的培养基上形成菌落。2.点突变是人类的很多遗传性疾病的原因，而且，目前已有充足的证据证明，人和实验动物体细胞的癌基因和抑癌基因的点突变与肿瘤发生有关。细菌回复突变试验具有快速、经济和操作相对简便等优点。很多试验菌株还具有某些特征，使其对某类致突变物更加敏感，这些特征包括回复突变位点的应答性DNA序列、细胞对大分

4、子物质的通透性增高以及DNA修复系统的消除(缺失)或DNA易错修复增多等。通过特异性菌株获得的试验结果可为遗传毒性物质诱发的突变类型提供有价值的研究资料。己建立了包含大量不同结构化学物的细菌回复突变试验结果的数据库，可以从中得到所需资料，同时，还为测试不同理化性质的化学物(例如可对挥发性物质)建立了完善的方法。3.细菌恢复突变试验应用的是原核细胞，其在吸收、代谢、染色体结构、DNA修复过程等方面与哺乳动物细胞都有差别。且本试验是体外试验，一般需要加入外源性代谢活化系统。但外源性代谢活化系统不能完全模拟体内代谢条件，因此，本试验的结果不能为受试样品对哺乳动物的致突变性和致癌性提供直接证据。4.细

5、菌回复突变试验通常作为遗传毒性初筛试验，尤其适用于对受试样品诱发点突变能力的检测。大量研究数据表明，很多在本试验中获得阳性结果的化学物在其他试验中也具有致突变活性。但也有一些致突变剂在本试验中(结果)为阴性的例子，本试验存在这种缺陷可能是由于检测终点的特殊性质、代谢活化过程不同以及生物利用度的差异等原因造成的。另一方面，一些使本试验灵敏度增加的因素也会造成对致突变活性估计过高。5.细菌回复试验不适合评价某些类型的化学物，例如，具有较强杀菌作用的化合物(如某些抗生素)、认为或已知对哺乳动物细胞复制过程有特异性干扰作用的化合物(如拓扑异构酶抑制剂、核昔酸类似物等)，这些物质选用哺乳动物的致突变试验

6、更合适。6.尽管很多在本试验中获得阳性结果的化学品是哺乳动物的致癌物，但这种相关性并不是绝对的，而是与化学物的种类有关。还有一些致癌物不能用本试验检出，因为这些物质是通过其他的、非遗传致癌机制或受试菌株不具备(存在)的机制引发癌症的。E GB/ T 21786-2008 化学品细菌回复突变试验方法1 范围本标准规定了化学品细菌回复突变试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报&.口。本标准适用于检测化学品(有杀菌作用的除外的致突变性。2 术语和定义下列定义和术语适用于本标准。2. 1 回复突变试验reverse mutation test 在鼠伤寒沙门氏菌Csalmonell

7、atyphimurium)或大肠杆菌(escherichiacoli)中检测需要氨基酸菌株(分别为组氨酸和色氨酸)的突变，以产生一株不依赖外界提供氨基酸的菌株。2.2 而基对置换突变荆base pair substitution mutagens 能够引起DNA碱基改变的物质。在回变试验中，这种改变可发生在原发突变位点，在细菌基因组中也可在第二位点发生突变。2.3 移码哭变Jframesbift mutagens 能够引起DNA中单个或多个碱基对的增加或缺失，继而改变了RNA的读码框的物质。3 试验基本原则3. 1 细菌悬液分别在加入或不加入外源性代谢活化系统的条件下与受试样品接触，在平皿掺入

8、试验中，将上述混合物与顶层琼脂充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板最低营养琼脂)上。在预孵育试验中，先将细菌悬液与受试样品混合进行预孵育，然后再与顶层琼脂充分混匀，迅速倾人底层琼脂平板(最低营养琼脂)上。上述平皿培养2d3 d后，计数回复菌落数并与溶剂对照组的自发回复菌落数进行比较。3.2 细菌回复突变试验有数种操作方法，其中最常用的是平皿掺入法、预孵育法、震荡培养法和悬浮培养法等。还有用于检测气体或蒸气的改良方法。3.3 本标准所描述的主要是平皿掺入法和预孵育法。这两种方法在加入或不加入代谢活化系统的条件下都能进行。有些化学品用预孵育法更有效，包括短链脂族亚硝腊、二价金属、醒类、偶氮染料和重氮化合

9、物、千里光生物碱、烯丙基化合物和硝基化合物。在研究中还发现某些类别的化学品用标准的方法，如平皿掺入法和预孵育法并非总能检出阳性结果，这种情况应视作特例，并强烈建议采用其他替代试验程序进行检测.在文献中，已用替代方法对下列特例的致突变性进行了鉴定同时提供了所用试验程序的例子), 特例一般包括偶氮染料和重氮化合物，气态或挥发性物质和葡萄糖音等。对标准方法的改动应有科学依据。4 试验方法4. 1 试验准备4. 1. 1 细菌4.1. 1. 1 新鲜的细菌培养物应生长至指数生长晚期或稳定期早期细菌浓度约为10个/mL)，生长已GB/T 21786-2008 达稳定期晚期的培养物不能使用.试验中所用的培

10、养物中的活菌滴度应较高.活菌滴度可根据细菌生长曲线的历史性对照数据确定，或在每次试验时通过滴片测定活菌数.4. 1. 1. 2 推荐的培养温度:37C。4.1. 1. 3 至少应用5种菌株，包括4个鼠伤寒沙门氏菌株(TA1535;TA1537或TA97a或TA97, TA98和TAIOO)，对这些菌株的检测结果可靠且不同实验室之间有较好的重现性。这四种菌株在初始回复突变位点有GC碱基对，已知它们不能检测某些氧化型致突变物、DNA交联剂和脚类物质.检测这些物质应选用在初始回复突变位点有AT碱基对的大肠杆菌WP2菌株或鼠伤寒沙门氏菌TAI02菌株。因此，推荐的菌株组合方案如下:鼠伤寒抄门氏菌TA1

11、535和鼠伤寒沙门氏菌TA1537或鼠伤寒沙门氏菌TA98鼠伤寒沙门氏菌TAl大肠杆菌WP2uvr 为检测DNA交联WP2 uvrA或大肠杆4. 1. 1.4 应按已建制品时均应进行氨其他的表型鉴定，4.括(pKMIOl)菌株对在例如:鼠伤寒uvrB突变使其对照数据范围内，最4. 1.2 培养基应用适宜的氨酸的顶层琼脂，4. 1. 3 代谢活化细菌应在有或无数。应根据受试样品的S9.对于偶氮染料或重氮化军4.2 试验条件4.2.1 溶剂/赋形荆AI02 DNA的大肠杆菌征性突变的存寒钮，、门氏菌的军数应在历史对和生物素或色导剂包括Aroclor9混f液5%-30%(体积分况B吃可使用一种以上浓

12、度的溶剂/贼形剂不应与受试样品发生化学反应，且对细菌的存活和S9的活性无影响。若选用的不是常用的溶剂或赋形剂体，应有资料提供适合的理由.能用水作溶剂或赋形剂的，应首先考虑以水作为溶剂或赋形剂.如受试样品对水不稳定，应选用不含水的有机溶剂或赋形剂。4.2.2 染毒剂量4.2.2. 1 应根据受试样品对细菌的毒性和在配制的最终混合物中的榕解度确定受试样品所用的最高浓度.建议先进行预试验测定受试样品的毒性和溶解度.可将回变菌落数的减少、背景菌苔体积变小、GB/ T 21786-2008 或处理后细菌存活率降低等作为细胞毒性的指征。代谢活化系统的存在可改变受试样品的毒性.在实际试验条件下，最终混合物出

13、现肉眼可见的沉淀即判断为不溶.对无细胞毒性的可溶受试样品，建议最高试验浓度应为5mg/皿或5L/皿，对无细胞毒性但溶解度达不到5mg/l皿或5L/皿的受试样品，在最终处理混合物中应有一个或多个浓度出现沉淀现象.在低于5mg/.llIL或5L/皿时即出现细胞毒性的受试样品，最高浓度应达到出现细胞毒性的浓度。沉淀不应影响结果计数。4.2.2.2 至少应选用5个可供分析的试验浓度.在开始试验时，剂量间隔一般为半对数例如.jO), 在研究剂量-反应关系时也可以采用更小的剂量间隔。4.2.3 对照4.2.3. 1 每次试验均应设置的条件下分别设置.加入4. 2.3. 2 为检验所用行代谢活化试验的阳刚果

14、红Cong苯并芭瞌n环瞬酷胶(2-氨基葱2-氨基惠选一种需要微叠氮销sodiumazi CASno. 56-57-5 峡喃糠酸胶f飞刷ura町r盯r4.2.3.4 也可以使用其他适合的阳性物.如可能可考虑使用化学类别相关的阳性对照物.4. 2.3.5 阴性对照在每次试验时除在试验培养基中只加入溶剂或载体外，其余处理应与各处理组相同。另外，如果没有历史数据证明所用溶剂或载体无毒性作用或致突变作用，还应设空白对照组不进行任何处理)。4.3 试验步骤4.3. 1 受试样晶处理4. 3. 1. 1 平皿掺入法:不需代谢活化时，通常将0.05mL或0.1mL受试样品溶液、0.1mL新鲜的细GB/T 21

15、786-2008 菌培养液(约含108个细菌)和0.5mL灭菌缓冲液与2.0mL顶层黯脂混合。如需代谢活化系统条件下，通常将0.5mL含适量后线粒体组分(体积约占代谢活化混合液总量的5%30%)的代谢活化混合物与细菌和受试物/受试溶液一起与顶层琼脂混合。将上述混合液充分混合后倒在最低营养琼脂上，待顶层琼脂凝固后放入培养箱培养。4.3. 1. 2 预孵育法，将受试物/受试搭液与受试菌株(约含108个细菌)和灭菌缓冲液或代谢活化系统(0.5 mL)在30.C37C预孵育20min或更长时间，再与顶层琼脂混合，然后倒在最低营养琼脂上。通常用0.05mL或0.1mL受试物/受试溶液、0.1mL菌液，0

16、.5 mLS9混合物或灭菌缰冲液，与2.0mL 顶层晾脂混合。在预孵育过程中应将试管放入震葫器中震葫充气。4.3. 1.3 为了评价结果的变异度，每个剂量水平应做三个平行平板，如有科学的理由也可做两个平行平板，偶尔丢失一个平皿的数据不影响结果的可靠性。4.3. 1. 4 气态或挥发性物质应采用适当方式测试，例如在封闭的培养皿中进行。4.3.2培养将试验中的所有平皿置于37C培养48h72 h.培养结束后计数每个平皿的回复突变菌落数。5 试验数据和报告5. 1 数据处理5. 1. 1 应列出每个平皿的回复突变菌落数。阴性对照(溶剂对照，有时还有空白对照)和阳性对照组各皿的回复突变菌落数也应记录。

17、5.1.2 应列出受试样品各组、阴性对照和阳性对照的每皿回复突变菌落数、平均回复突变菌落数和标准差。5.1 3 对明确的阳性结果无需进行验证试验。可疑结果最好通过改进试验条件进一步试验来澄清。阴性结果需视具体情况决定。如认为阴性结果无需进行验证试验，应说明理由。在随后的试验中应改进试验参数以扩大评价条件范围，改进的参数包括浓度间距、处理方法(平皿掺入或溶液预孵育等)和代谢活化条件。5.2 结果评价和解释5.2.1 阳性结果判定有几个标准。如受试样品各组回复突变菌落数的增加呈剂量-反应关系，或至少有一个菌株在有或无代谢活化系统条件下，在一个或几个剂量水平每皿回复突变菌落数出现可重复的增加。应首先

18、考虑结果的生物学意义。统计学方法可用于帮助评价试验结果，但不能作为阳性反应判定的唯一因素。5.2.2 不符合以上标准的受试样品则被认为在本试验中无致突变性。5.2.3 尽管多数试验都能给出明确的阳性或阴性的结果，但也不排外极少数试验不能对受试样品活性做出明确判断，例如，无论重复试验多少次，结果仍模棱两可或可疑。5.2.4 细菌回复突变试验的阳性结果表明受试样品可引起所用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌的基因组发生碱基置换或移码突变诱发的点突变。可重复的的浓度-反应关系意义较大。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起试验菌株的突变。5. 3 试验报告试验报告应包括以下信息:5.3. 1 受试样品4 a

19、) 名称和识别码如CAS编号(如已知); b) 物理性质和纯度;。与试验实施相关的物理化学特性;d) 受试样品稳定性(如了解)。GB/T 21786-2008 5.3.2 榕剂/赋形剂a) 选择溶剂/赋形剂的理由;b) 受试样品在溶剂/J盹形剂中的需解性和稳定性(如了解)。5.3.3 细菌a) 所用菌株zb) 每皿加入的细菌数;c) 菌株特征。5.3.4 试验条件a) 每皿加入受试样品的量(mg/皿或g/皿)，剂量选择的依据，每个浓度的平皿数;b) 选用的培养基pc) 代谢活化系统的类型和成分，包括判断可接受的标准;d) 处理过程。5.3.5 结果a) 毒性表现;b) 沉淀现象;c) 每个平皿

20、的菌落计数;d) 每皿平均回变菌落数和标准差ze) 剂量-反应关系(如可能); f) 统计学分析(如有); g) 同期阴性(榕剂/ljjt形荆)和阳性对照数据(包括数据范围、均数和标准差); h) 历史性的阴性(溶剂/赋形剂)和阳性对照资料(包括范围，均数，标准差。5.3.6 结果讨论。5.3.7 结论。5 OON|hFNH函。华人民共和国家标准化学晶细菌回复突变试验方法GB/T 21786- 2008 国中 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张O.75 字数13千字2008年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2008年7月第一版 定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066.1-32 187 GB/ T 21786-2008