GB T 14233.2-1993 医用器具输液、输血、注射器检验方法 第2部分 生物分析方法.pdf

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1、中华人民共和国国家标准医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:生物试验方法Infusion , transfusion, i时ctionequipment for medical use-P町t2: Biological test methods 1 主题内容与适用范围GB/T 14233.2-93 本标准规定了医用输液、输血、注射器具成品及材料的生物性能试验方法。本标准适用于医用高分子材料制成的医用输液、输血、注射及其配套器具生物性能试验。其他医用高分子制品亦可参照采用。2 无商试验2. 1 定义第-篇成晶试验无菌试验系指检查供试品是否无菌的一种方法。2.2 主要设备超净工作台、光学显微镜

2、、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。2.3试剂蛋白陈、牛肉膏、酵母膏、琼脂、葡萄糖、磷酸二氢梆、氯化锅、氮氧化销、硫酸楼、膜酶醋脉、L-胧氨酸、硫乙醇酸锅、0.9%氯化纳注射液。2.4 培养基2. 4. 1 培养基制备2.4.1.1 培养基所用的陈、牛肉膏、酵母膏、琼脂先配少量培养基观察其灭菌后是否有混浊，长菌情况是否良好。在更换厂牌号时应重试。2. 4. 1. 2 制备各种培养基时，可用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化销溶液适量调节pH值，使灭菌后的pH值在规定范围内。2.4. 1. 3 几种培养基配方及操作步骤应符合附录A规定。2.4.2 培养基要求2. 4. 2. 1 在使用前

3、，细菌培养基须经3035C培养48h.霉菌培养基经2025C培养国家技术监督局1993-03-16批准1993-11-01实施175 GB/T 14233. 2-93 72 h.证明无菌方可使用。2.4.2.2 制备好的需气菌、厌气菌培养基4C保存.15d内用完，管内厌氧区小于液面高度的二分之一不得使用。其他培养基30d内用完。2.4.3 培养基质量检查2.4.3.1 需气菌、厌气菌培养基经接种每1mL含100个以下的藤黄八叠球菌(28001)菌液1mL.置3035C培养24h后，应生长良好。2.4.3.2 需气菌、庆气菌培养基经接种每1mL含50个以下的生抱梭菌(64941)菌液1 mL，置

4、3035C培养24h后，应生长良好。2.4.3.3 霉菌培养基经接种每1mL含50个以下的白色念珠茵茵液1mL.置2025C培养24h后，应生长良好。2.5 试验前准备2.5.1 器具灭菌与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121C30 min.或置电热于燥箱内160C2 h. 2.5.2 无菌室元菌程度要求无菌室在消毒处理完毕后.J1;.检查空气中的菌落数，方法如下g取内径90mm双碟，无菌操作注入融化的普通肉汤琼脂培养基20mL.制成平板，先在3035C培养48h证明无菌后，取双碟平板3只，在无菌室内以平均位置，打开碟盖，在空气中暴露30min后盖好，置3035C培

5、养48h后取出检查.3只双碟上生长的菌落数平均不得超过3个，单只碟内菌落不得超过4个。无菌试验过程中也需检查无菌室的元菌程度，方法同上。在试验开始进行时，打开碟盖在空气中暴露，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。2.6 对照菌液制备金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌液z取金黄色葡萄球菌(26003)的普通琼脂斜面新鲜培养物.接种一白金耳至需气菌、厌气菌培养基内.在3035C培养1618h后.用无菌0.9%氯化纳注射液稀释成1I 10即得。2. 7 试验方法2.7. 1 供试品数量同一批号至少3个单位供试品.2.7.2 浸提介质0.9%元菌氯化销注射液2.7.3

6、供试液制备及接种2.7.3.1 供试液制备及接种应按无菌操作法进行。2.7.3.2 管类器具2按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量为10 mL/min。2.7.3.3 容器类器具z容器内己装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液，如未装液体则按容器内表面积每10cm加入浸提介质1mL.振摇数次。2.7.3.4 小型配件或实体类器具s小型配件或实体类器具可直接投放人培养基内p大型实176 GB/T 14233. 2-93 体类器具按表面积每10cm2加入浸提介质1mL，振摇数次。2.7.3.5 供试液应在制备后2h内使用。2.7.3.6 每批供试液分别接种于需气菌、厌气菌培养基5

7、管，其中1管接种金黄色葡萄球茵茵液1mL，供作阳性对照。另接种于霉菌培养基2管。供试液的每管接种量与培养基的分装量按表1规定。表1mL 供试液总量每管接种量培养基分装量2 O. 5 15 2-20 1. 0 20 5. 0 40 2.7.3.7 接种后，需气菌、厌气菌培养基在3035C培养5d，霉菌培养基在2025C培养7 d. 2.7.4 结果判定当阳性对照管显混浊并确定有细菌生长时(应在接种后24h有细菌生长)，可根据观察所得的结果判定。2. 7. 4. 1 如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格。2.7.4.2 如需气菌、厌气菌及霉菌培养管

8、中任何一管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样依法复试两次。除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。2.7.4.3 如在加入供试液后，培养基出现混浊或沉淀，经培养不能从外观上判断时，可取该培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养4872h后，观察是否再现混浊或在斜面上有元离生长，并在转种的同时，取少量培养液，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。3 热原试验3. 1 定义本法系将一定剂量的供试液，静脉注入家兔体内，在规定的时间内，观察家兔体温升高的情况，以决定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。3.2 主要设备及用具超净工作台、电热干燥箱、压力

9、蒸汽灭菌器、兔固定器、J!I门体温计。3.3 试剂0.9%氯化纳注射液。3.4 供试用家兔3.4. 1 一般要求供试用家兔应健康元伤，毛色光滑，脏门正常，体重1.7-3. 0 kg，雌雄皆可，雌兔应无孕。测温前7d应用同一饲料饲养，在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常177 GB/T 14233.2-93 现象。3.4.2 供试用家兔的挑选3.4.2.1 未经使用于热原检查的新兔，应在试验前7d内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品相同，但不注射药液，每隔1h测量体温1次，共测4次，体温均在38.。39. 6C的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4c为符合规定，方

10、可供试验用。3.4.2.2 己用于热原检查的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48h，方可供第二次检查用。其中升温达0.6C的家兔，应休息两周以上，再按新兔一样测量体温，合格后方可继续供试验用;如供试品判定为不符合规定，且其组内家兔平均升温达O.8C或更大时，则组内全部家兔不再使用;两次升温或降温超过合格范围的家兔亦不再使用。3.4.2.3 两次使用的间隔时间如超过3周时，应按新兔一样测量体温。3.4.2.4 每一家兔的使用次数不应超过10次。3.5 试验前准备3. 5. 1 器具灭菌与除热原与供试液接触的所有器具置电热干燥箱内，180C干烤2h或250C干烤30miflo 3.5.2

11、虹门体温计检定脏门体温计应经法定计量检定，并在检定周期内使用。注.脏门体温计的精度，39-C以上允差士o.lS-C ，39C以下允差士0.1c。检定周期为一年。3.6 试验方法3.6. 1 供试品数量同批号至少3个单位供试品。3.6.2 浸提介质0.9%无菌元热原氯化销注射液。3.6.3 供试液$IJ备3.6.3.1 供试液制备应按无菌操作法进行。飞3. 6. 3. 2 管类器具z按管内表面积每3cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量为10 mL/min, 3.6.3.3 容器类器具g容器内已装有液体可直接抽取容器内液体为供试液;如未装液体则按容器内表面积每3cm2加入浸提介质1mL，振摇5次，

12、已灭菌供试品置37C2 h，未灭菌供试品置60C2 h。3.6.3.4 小型配件或实体类器具2将供试品放入一元菌、无热原具塞器皿内，按供试品表面积每3cm2加人浸提介质1mL，振摇数分钟，使供试品完全浸设为止，已灭菌供试品置37C2 h，未灭菌供试品置60C2 h , 3.6.3.5 未灭菌供试品浸提液使用前应量压力蒸汽灭菌器内1l5C灭菌30mino 3.6.3.6 供试液应在$IJ备后2h内使用。3.6.4 试验用家兔准备3.6.4. 1 试验用家兔数量:一批供试品用兔初试3只，复试5只。3.6.4.2 预测体温z试验前2h停止喂食到试验完毕。禁食2h后，预测体温两次，间隔时间3060mi

13、n，两次体温之差不超过O.2C ，以两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当178 GB/T 14233.2-93 日使用的家兔体温应在38.039. 6C的范围内，同一批供试品使用的家兔，各兔间正常体温之差不得超过1C。3.6.4.3 测温方法家兔装在固定器内，应防止骚动，30min后开始第次测温。将脏门体温计或iJim温探头缓缓插入兔E工门，深度为6cm，测混时间每兔至少2rnin。测温时如兔骚动，应待其安静10min后再测温。3.6.5 供试液注射及注射后测温3.6.5.1 在测定家兔正常体温符合要求后15min内，自兔耳静脉缓缓注入温热至38C的供试液，注射剂量为10mL/kg。3.6.

14、5.2 注射完毕每隔1h测量体温I次，共测3次，以3次体温中最高的1次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。3.6.6 家兔降温的处理降温小于或等于O.4C视为兔体温正常波动的范围，以0计。降温值大于或等于0.6C应重试。降温值大于0.4c至小于0.6C之间，若3只兔中仅有1只在此范围内以0计，若3只兔中有2只或2只以上在此范围内应重试.3.6.7 注意事项3.6.7.1 热原试验室内外均应保持安静，避免强烈直射的日光或灯光及其他刺激。3.6.7.2 在试验全过程中，避免家兔骚动，保持体温稳定。3.6.7.3 在试验前12d.供试用家兔应处于同一温度环境中，试验室和饲养室的温度差不得大于5C.

15、试验室温度为1728C。在一次试验全过程中，室温变化不大于5C，并注意相对湿度保持稳定。3.6.7.4 复试时应取试验次数较少的家兔。3.6.7.5 试验过程中，家兔因胆门出血多造成升温或降温超过规定时应重试。3.6.7.6 在试验全过程中，不得随意更换脏门体温计。3.6.8 结果判定3.6.8.1 在初试3只家兔中，体温升高均在o.6C以下，并且3只家兔体温升高总数在1. 4C以下时;或在复试5只家兔中升温0.6C或0.6C以上的兔数不超过1只，并且初试复试合并8只家兔的升温总数不超过3.5C时，均应认为供试品符合热原检查规定。3.6.8.2 初试3只家兔中，若有1只家兔升温o.6C或0.6

16、c以上或3只兔升温均低于O. 6C ，但升温总数达1.4C或1.4C以上时，应另取5只兔复试，检查方法同上。3.6.8.3 初试3只兔升温O.6C或o.6C以上兔数超过1只时，或在复试5只兔中升温0.6C或0.6C以上兔数超过1只，或在初试复试合并8只兔升温总数超过3.5C时，均应认为供试品不符合热原检查规定。4 细苗内毒素试验4. 1 定义及适用范围本法系列用掌试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。179 GB/T 14233. 2-93 4.2 主要设

17、备超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。4.3 试剂4.3. 1 细菌内毒素国家标准品=用于仲裁益试剂灵敏度和试验中阳性对照。4.3.2 细菌内毒素工作标准品z用于标定笙试剂灵敏度和试验中阳性对照。4.3.3 堂试J，灵敏度为0.25EU/mL，规格为0.5mL。4.3.4 元热原水z内毒素含量小于0.05EU/mL。4.4 试验前准备4. 4. 1 器具除热原与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内180(:干烤2h，或250(:干烤30min;塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60C烘干备用。4.4.2 堂试剂灵敏度测定4.4.2.1 试验前应核对使用批号锺

18、试剂的灵敏度，应符合规定。4.4.2.2 灵敏度测定E根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用元热原水以12等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液.取同一批号堂试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为堂试剂浴解液。取10mmX75 mm试管若干支，分别加人0.1mL笙试剂溶解液，加入内毒素稀释液。.1mL，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37士1(:恒温水浴中保温60士2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应均为阴性。按式(1)计算标准差2s= 式中，s-一一标准差5zz2(ZZ至一一4 3 Z一-4个连续内毒素稀释液最低阳性

19、结果浓度的对数值。当s0.365时，按式(2)计算本批堂试剂灵敏度()，当s二三0.365时，测定无效。4.5 试验方法4.5. 1 供试品数量同一批号至少3个单位供试品。4.5.2 浸提介质无热原水。4.5.3 供试液制备= log-l (于)( 1 ) . ( 2 ) 在元菌条件下，每套输液器内腔注入10mL，输血器内腔注入15mL浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37士1(:恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无菌元热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h. 180 GB/T 14233. 2-93 4.5.4 试验步骤将堂试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加人无热原水溶解。

20、细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5EU/mL，供作阳性对照。取10mmX75 mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1mL供试液，阴性对照管2支各加入0.1mL元热原水，阳性对照管2支各加入0.1mL内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1mL锺试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37土1C水浴中保温60土2min，轻轻取出，观察结果。4.5.5 结果判定4. 5. 5. 1 将试管缓慢倒转180，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为(+l.不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为(一)。4.5.5.2 供试品2管均为(-)性时，判定产品符合本法规定，不再进行热原试

21、验。4.5.5.3 供试品2管均为(十)或有1管为(+)时，用无热原水将供试液12等比稀释按上述方法重试，供试品操作4管。如4管均为(-)，判定产品符合本法规定，不再进行热原试验。4.5.5.4 重试供试品4管中有l管为(+)时，判定产品不符合本法规定，应进行热原试验，并根据试验结果判定。4.5.5.5 供试品细菌内毒素限量应不超过0.5EU/mL, 4.5.5.6 阳性对照2管应均为(+)，阴性对照2管应均为(-)，否则试验无效。5 急性金身毒性试验5. 1 定义本法系将一定剂量的供试液由静脉注入小白鼠体内，在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情况，以决定供试品是否符合规定的一种方法。5

22、.2 主要设备及试剂压力蒸汽灭菌器、动物天平、0.9%氯化纳注射液。5.3 试验前准备5. 3. 1 器具灭菌与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内115C30 min。5.3.2 试验动物准备5.3.2.1 试验用小白鼠应健康无伤，毛色光滑，眼睛红亮活泼。须在同一饲养条件下饲养，同一来源，同品种，雌者无孕，体重1723g。做过本试验的小白鼠不得重复使用。5.3.2.2 将小白鼠随机分为试验和对照两组，每组5只。复试时每组取1819g的小白鼠10只。5.4 试验方法5. 4. 1 供试品数量每批供试品至少2个单位供试晶。5.4.2 浸提介质0.9%无菌无热原氯化饷注射液。5.4.3 空白对照

23、液181 GB/T 14233.2-93 0.9%元商元热原氯化锅注射液。5.4.4 供试液制备5.4.4.1 供试液制备应按无菌操作法进行。5.4.4.2 管类器具:管内腔注入浸提介质至最大容液量，两端封闭，置60C8 h, 5. 4. 4. 3 容器类器具=容器内注入浸提介质至公称容量，置60C仙。5.4.4.4 小型配件或实体类器具z供试品放入一无菌具塞器皿内，按供试品表面积每3cm2 加入浸提介质1mL，振摇数分钟.使其浸没为止，置60C8 h, 5.4.4.5 未灭菌供试品浸提液使用前应置压力蒸汽灭菌器内115C灭菌30mino 5.4.4.6 供试液应在制备后24h内使用。5.4.

24、5 供试液注射及注射后动物反应观察指标5.4.5.1 将小白鼠放人固定器内，自尾静脉分别注入供试液和空白对照液，注射速度为0.1 mL/s.注射剂量为50mL/kg , 5.4.5.2 注射完毕后，观察小白鼠即时反应，并于4、24、48和72h观察和记录试验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。5.4.5.3 注射动物反应观察指标按表2规定。表2症状中| 腹部剌激症状，呼吸困难，运动减少，眼险下垂，腹泻重| 衰竭，发钳，震颤，严重腹部剌激症状，眼险下垂，呼吸困难死亡| 注射后死亡5.4.6 注意事项5. 4. 6. 1 注射完毕如发现有血或供试液外溢现象，此小臼鼠应弃去，另取小白鼠依

25、法操作。5.4.6.2 试验后待观察小白鼠喂养方法同试验前。5.4.6.3 试验用小白鼠盒内数量不宜过多，避免照成发热，出汗影响试验结果。5.4.6.4 实验室与饲养室室温控制在1928C。5.4.7 结果判定5. 4. 7. 1 在72h观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判定供试品合格。5.4.7.2 如试验组动物有2只以上出现中度毒性症状或死亡，则判定供试品不合格。5.4.7.3 如试验组动物有2只以上出现轻度毒性症状，或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡，则另取体重1819 g小白鼠10只为1组进行复试，复试结果符合5.4.7.1条要求，判定供试品合格。6 溶血试验6. 1

26、 定义本试验是通过供试品与血液直接接触，测定红细胞释放的血红蛋臼量以检测供试晶体182 外溶血程度的一种方法。6.2 主要设备GB/T 14233. 2-93 恒温水浴、分光光度计、离心机。6.3 试剂2%草酸饵溶液、0.9%氯化纳注射液。6.4 试验方法6. 4. 1 供试品数量同一批号至少2个单位供试品。6.4.2 浸提介质0.9%氯化锅注射液。6.4.3 供试品制备称取供试品15g.管类器具切成0.5cm长小段;其他类型器具切成0.5cmX2cm条状或块状。6.4.4 新鲜稀释抗凝兔血制备6.4.4.1 由健康家兔心脏采血20mL.加2%草酸御1mL.制备成新鲜抗凝兔血。6.4.4.2

27、取新鲜抗凝兔血8mL.加0.9%氯化纳注射液10mL稀释.6.4.5 试验步骤6.4.5.1 供试品组3支试管，每管加入供试品5g及0.9%氯化纳注射液10mL，阴性对照组3支试管，每管加入0.9%氯化销注射液10mL，阳性对照组3支试管，每管加入蒸馆水10 mL。6.4.5.2 全部试管放入恒温水浴中37C保温30min后，每支试管加人0.2mL稀释兔血，轻轻混匀，置37C水浴中继续保温60min. 6.4.5.3 倒出管内液体离心5min(2 500 rpm)。6.4.5.4 吸取上清液移入比色皿内，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。6.4.6 结果计算6.4.6.1 供试品组和对

28、照组吸光度均取3支管的平均值。阴性对照管的吸光度应不大于0.03，阳性对照管的吸光度应为0.8土O.3。6.4.6.2 溶血率按式(3)计算zA-B 溶血率(%)=一一一X100 . . . . . . . ( 3 ) C-B 式中=A一一供试品组吸光度;B一阴性对照组吸光度;C 阳性对照组吸光度。6.4.7 结果判定溶血率小于5%判定供试品合格。183 7 细胞毒性试验7. 1 定义GB/T 14233.2-93 第二篇材料试验本试验是将定量的供试液加入细胞培养液中，培养L-929细胞，通过对L-929细胞生长和增殖影响的观察，评价供试品对细胞的潜在毒性作用。7.2 主要设备及用具超净工作台

29、、电热恒温培养箱、冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、液氮瓶、培养瓶。7.3 试剂乙醇、苯盼、台盼蓝、小牛血清、青霉素G(销盐)、硫酸链霉素、乙二胶囚乙酸二销(EDTA)、膜酶、Earle液、Hanks液、D-Hanks液、Eagie培养液、细胞培养液、细胞消化液。7.4 几种平衡盐溶液(BSS)和细胞培养液、消化液配制应符合附录B规定。7.5 细胞株推荐使用L唱929细胞(小鼠成纤维细胞)。试验采用L-929传代4872h生长旺盛的细胞。7.6 器具灭菌与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121c灭菌30mn c 7.7 试验方法7.7. 1 供试液制备7.7. 1. 1 将供

30、试品薄片用肥皂水清洗除去油污，再用重蒸馆水冲洗干净，滤纸吸干后切成0.5 cmX2 cm条状，用压力蒸汽灭菌或紫外线照射消毒。7.7. 1. 2 将供试品放人一无菌培养瓶内，按供试品表面积每1cm2加入细胞培养液10 mL.封闭瓶口置37C24 h. 7.7.2 细胞培养7. 7. 2. 1 细胞培养应按无菌操作法进行。7.7.2.2 细胞悬液制备z将已培养4872h生长旺盛的L-929细胞用消化液消化510 min, Hanks液洗涤23次，加人细胞培养液，用吸管把细胞从瓶壁上吹打下来。混匀后取0.9mL加0.4%台盼蓝溶液0.1mL.混合。4min后用血球计数板在显微镜下计数，按式(4)计

31、算出细胞浓度(单位为细胞数/mL原液): 中央和四角5?格内细胞总数川00 ( 4 ) 根据实测细胞浓度，将适量细胞培养液加入培养瓶，配制成40OOO/mL的细胞悬液备用。7.7.2.3 取培养瓶33只，分别加入细胞培养液4mL.细胞悬液1mL，置37C培养24h。7.7.2.4 培养24h后弃去原培养液。阴性对照组13只培养瓶(其中l只备用)加入新鲜184 GB/T 14233. 2-93 的Eagle细胞培养液;阳性对照组10只培养瓶。只备用)加入含6.3%苯自由的细胞培养液;供试品组10只培养瓶(只备用)加入含50%供试液的细胞培养液。置37C继续培养。7.7.3 细胞形态学观察和计数7

32、. 7. 3. 1 在更换培养液的当天，取阴性对照组3瓶，并在更换后第2、4、7d.每组各取3瓶进行细胞形态学观察和细胞计数。7.7.3.2 细胞形态用倒置显微镜观察，并摄影对比。7.7.3.3 加人适量消化液消化，然后制成细胞悬液，用血球计数板在显微镜下计数，并按式(4)计算细胞浓度。7.7.4 毒性评定7.7.4.1 细胞形态分析标准按表3规定表3细胞形态程度无毒轻微毒中等毒细胞形态正常，贴壁生长良好，L-929细胞呈棱形或不规则三角形细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮死细胞细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见悬浮死细胞严重毒| 细胞基本不贴壁，90%以上呈悬浮死细胞

33、7.7.4.2 根据各组细胞浓度按式(5)计算细胞相对增殖度(RGR): RGR= x 100% .( 5 ) 7.7.4.3 细胞相对增殖度分级标准按表4规定g表4分级。1 2 3 4 5 7.7.5 结果评价7.7.5.1 相对增殖度供试品组为0或1级判为合格。相对增主主10075-99 50-74 25-49 1-24 。7.7.5.2 相对增殖度供试品组为2级，应结合形态分析，综合评价。7.7.5.3 相对增殖度供试品组为35级判为不合格。B 皮肉剌激试验8. 1 定义殖度本试验系将一定量的供试液注人家兔皮内，通过对其局部皮肤反应的观察，评价供试品185 对接触组织的潜在刺激性。8.2

34、 主要设备及用具GB/T 14233. 2-93 压力蒸汽灭菌器、兔固定器、皮内注射器。8.3 试剂75%乙醇、0.9%氯化制注射液。8.4 实验动物准备8. 4. 1 健康新西兰兔，体重2.O2. 5屿，无任何皮肤疾病或损伤，未做过任何试验e8.4.2 初试用兔2只，复试用兔3只。8.4.3 试验前24h在兔脊柱两侧各剪剃5crnX 15 crn区域兔毛，应避免损伤皮肤。8.5 试验方法8. 5. 1 浸提介质。.9%氯化销注射液。8.5.2 空白对照液0.9%氯化纳注射液。8.5.3 供试液制备供试品预处理同7.7.1.1条，切成0.5crnX2 crn条，放人玻璃器皿肉，按其表面积每3

35、cmz加入浸提介质1mL，封闭后置压力蒸汽灭菌器内121c漫提1h.即得供试品浸提液。不加供试品，同条件制l备空白对照液。8.5.4 注射方法用75%乙醇清洁暴露皮肤，在兔脊柱一侧选择10个点，每点间隔2cm，各点注射O.2 rnL供试品浸提液g脊柱另一侧选择5个点，每点间隔2cm，各点注射0.2rnL空白对照液。8.5.5 结果观察8.5.5.1 注射后24h、48h和72h观察注射局部及其周围皮肤组织反应，包括红斑、水肿和坏死等。8.5.5.2 皮肤反应记分标准按表5规定。红无红斑现象轻度红斑勉强司见明显红斑(淡红色)斑表5记分水肿。I无水肿现象1 I轻度水肿勉强可见皮肤增厚2 I明显水肿

36、(隆起而轮廓清楚)记分。1 2 中度红斑(鲜红色)3 I中度水肿(隆起近1mm) 3 重度红斑(紫红色伴高轻微焦癫形成)4 I重度水肿(隆起大于1mm) 4 8.5.6 结果评价8.5. 6. 1 试验侧皮肤反应不超过对照侧皮肤反应，则表明供试液对皮肤无刺激作用。8.5.6.2 试验侧皮肤反应有2处以上明显超过对照侧反应，则表明供试液对皮肤有剌激作用。8.5.6.3 试验侧仅有1处呈明显或严重反应时，则应另选3只兔进行复试。复试试验侧与186 GB/14233.2-93 对照侧反应无明显差别时，则可通过本试验。9 皮肤致敏试验9. 1 定义本试验系将一定量的供试液与豚鼠皮肤接触，以检测供试品是

37、否具有引起接触性皮肤变态反应的可能性。9.2 主要设备及用具压力蒸汽灭菌器、电剃刀、皮下注射器、玻璃研钵等。9.3 试剂75%乙醇、0.9%氯化纳注射液、5%甲隆溶液、10%十二烧基硫酸锅、弗氏完全佐剂。9.4 试验前准备9. 4. 1 器具灭菌与供试液接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121c灭菌30mino 9.4.2 实验动物准备9.4.2.1 白色豚鼠，体重300500g，雌雄均可，每组至少10只。9.4.2.2 试验前24h剃除豚鼠肩背部4cmX6 cm区域毛发。9.4.3 弗氏完全佐剂(CFA)制备9.4.3.1 无水羊毛脂与液体石蜡的体积比为4I 6(如冬天，使用比例为3:日。将无

38、水羊毛脂加热溶解后取40mL置研钵中，稍冷却后，边研磨边加液体石蜡，直至60mL液体石蜡加完。置压力蒸汽灭菌器内1150C灭菌30min，即制备成弗氏不完全佐剂。FA)，4C保存备用。9.4.3.2 在IFA中按45mg/mL加入死的或减毒的分校杆菌(如卡介苗或结核杆菌), 即得弗氏完全佐剂。9.5 试验方法9.5. 1 浸提介质0.9%氯化销注射液。9.5.2 阴性对照液0.9%氯化锅注射液。9.5.3 阳性对照液5%甲H溶液。9.5.4 供试液和l备9. 5. 4. 1 供试品浸提液和阴性对照液制备同8.5.3条。9.5.4.2 将供试品浸提液或阴、阳性对照液与CFA等体积混合，用力搅拌数

39、分钟至完全乳化为止。9.5.5 诱导9.5.5.1 用75%乙醇清洁豚鼠背部去毛区，在每只豚鼠去毛区作6点对称的皮内注射，各点相距1，._，2cm，注射位置如下图所示z187 GB/T 14233. 2-93 0.1 mL CFA O. 1 mL供试晶漫提檀或阴、阳性对照掖0.1 mL供试晶漫提穰或田、阳性时照穰与CFA的乳化4IJ皮内注射位置图9.5.5.2 皮内注射后7d，在注射部位再次剃毛，用75%乙碎清洁。若未出现剌激反应，每一试验区用10%十二烧基硫酸纳石蜡液预处理，在局部斑贴前24h涂抹、按摩试验区皮肤，24 h后将2cmX4 cm滤纸浸入供试品浸提液或阴、阳性对照液中至饱和，将其

40、贴敷于豚鼠背部注射部位，封闭固定48ho 9.5.6 激发于诱导完成后14d，在豚鼠左右腹侧未用过处剃毛，用75%乙醇清洁，将2cmX2 cm 滤纸浸入供试品浸提液或阴、阳性对照液中至饱和，将其贴敷于剃毛区，封闭固定24ho 9.5.7 结果观察将贴敷物取下后1、24和48h，分别观察贴敷处红斑和水肿，按表6和表7给各点记分并分级.表6致敏反应记分标准红斑记分水肿无红斑现象。元水肿现象轻度红斑(勉强可见1 轻度水肿勉强可见皮肤增厚)明显红斑(淡红色2 明显水肿(隆起而轮廓清楚中度红斑(鲜红色3 中度水肿(隆起近1mm) 重度红斑(紫红色伴有轻微焦蹦形成)4 重度水肿(隆起大于1mm边界超过接触

41、区)表7致敏反应率分级标准致敏率13，%分度分级。8I 与阴性对照元差别928 E 轻微反应2964 E 中度反应6580 H 强烈反应81lOO V 极强反应注，1)致敏率等于过敏动物所占实撞动物的百分比.9.6 结果判定9. 6. 1 按1、24、48h情况列表，如激发部位记分为2或大于2，则认为致敏。188 记分。1 2 3 4 G/T 14233. 2-93 9.6.2 如阴性对照组或供试品组中超过50%的实验动物的记分为1或60%的阳性对照动物的反应记分小于2.应重复试验。10 短期肌肉植入试验10. 1 定义本试验系将一定大小和形状的供试品采用手术法或注射法植入家兔背部肌肉内，观察

42、植入后不同时间试样周围组织反应程度，以评价供试品对组织的刺激性和相容性。10.2 主要设备及用具压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱、常规外科手术器械、穿刺针。10.3 试剂和药品戊巴比妥铺、硫喷妥锅、腆町、75%乙醇、0.9%氯化销注射液。10.4 试验前准备10. 4. 1 器具灭菌与供试品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121c灭菌30min或电热干燥箱内160C 2 h. 10. 4. 2 实验动物准备10. 4. 2. 1 选用健康新西兰兔，体重2.5-3kg.每批供试晶用兔6只。10.4.2.2 试验前24h剪去兔脊柱两侧10cmX15 cm区域兔毛，应避免损伤皮肤。10.4.3 供试品与对

43、照样品的加工和处理10.4.3.1 对照样品推荐选用预试合格的医用级热硫化甲基乙烯基硅橡胶。10. 4. 3. 2 供试品和对照样品均加工成直径为1mm、长度为10mm的圆柱形试条，应表面光滑，边缘平整。10.4.3.3 试条用肥皂水、清水和蒸馆水依次清洗干净，滤纸吸干后浸入75%乙醇溶液内浸泡20min，植人前再用无菌生理盐水浸洗3次。10.5 试验方法10.5. 1 麻醉和消毒麻醉采用静脉注射戊巴比妥纳25-30mL/kg或硫喷妥销15-20mg/峙。按外科常规手术要求以腆町和75%乙醇彻底消毒手术区域。10. 5. 2 孚术步骤按外科常规手术要求进行操作。在兔脊柱两侧约2.5mm处等距离

44、各选4个植入点，每点间隔2cm，一侧植入供试品，另一侧植入对照样品.用手术刀片切开植入点皮肤，分离皮下组织和筋膜。手术法以止血钳分离肌肉，将试条送入深度为1-2cm的肌肉内，注射法采用穿刺针与脊柱平行成30角刺入肌肉内，取一探条插入针头内，将试条推入肌肉内，退出针头与探条。用外科缝合线缝合肌筋膜和皮肤切口。植入时如有过量出血，应在另一位置重新植入备用试样。10.5.3 结果观察10.5.3.1 临床观察植入后1-3，5d观察植入点皮肤反应，有无出血、红肿、坏死和试样排出等异常现象。189 GB/T 14233. 2-93 10.5.3.2 解剖观察植入后于14d和28d分别处死实验兔3只，解1

45、ft!后肉眼观察植入部位有元皮下和肌肉异常病变，取出脊柱两侧肌肉，切取包裹试样周围O.51. 0 cm的肌肉组织，置10%甲隆溶液中固定。10.5.3.3 组织病理学检查将固定组织石蜡包埋切片，HE和VG染色，每块肌肉做两种染色，每种染色各做两张组织学切片，于光学显微镜下观察，比较供试晶与对照品周围的组织反应，纤维囊腔厚度，炎症细胞和其他细胞存在情况及试样/组织界面处的其他异常情况等。10.5.4 组织反应分级10.5.4.1 炎性反应分级按表8规定。N级10.5.4.2 炎试样周围未见炎性细胞试样周围仅见极少量淋巴细胞表8性反试样周围有少量淋巴细胞，偶见多核异物巨细胞应试样周围可见毛细血管、

46、小血管扩张、有少量嗜中性粒细胞试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，其中有体积较大的组织细胞、吞噬细胞、毛细血管和小血管纤维囊腔形成分级标准按表9规定.表9级别纤维囊腔形成0级|囊壁较薄，由少量胶原纤维和12层纤维细胞组成I级|囊壁有变薄而致密趋势，由少量胶原纤维细胞组成，偶见纤维母细胞E级|试样周围形成囊腔结构，主要由纤维母细胞、胶原纤维和少量纤维细胞组成E级|试样周围形成疏松的囊壁，可见毛细血管和纤维母细胞N级|试样周围可见增生的毛细血管、小血管和组织细胞10.5.5 结果判断10. 5. 5. 1 植入14d后炎性反应程度应不大于皿级，囊腔形成至少为lV级。10. 5. 5. 2

47、 植入28d后炎性反应程度应不大于E级，囊腔形成至少为田级。10.5.5.3 供试品和对照品组织学观察比较，供试品反应程度超过对照组的组织切片数不得多于总数的1/4.190 A1 需气菌、厌气菌培养基GB/T 14233. 2-93 附录A培养基制备(补充件)成分z酷陈(膜酶水解)葡萄糖L-胧氨酸硫乙醇酸销(或硫乙醇酸酵母浸出粉氯化纳新鲜配制的0.1%刃天青溶液15日5 g O. 5 g 0.5 g 0.3 mL) 5 g 2.5 g 1. 0 mL (或新鲜配制的0.2%亚甲蓝溶液。.5mL) 琼脂O. 50. 7 g 水1000 mL 制法z除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温

48、溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1土O.2 .分装后置压力蒸汽灭菌器内115C灭菌30mn，即得。A2 霉商培养基成分g陈葡萄糖5 g 10 g 磷酸二氢饵(KH2PO，)1 g 硫酸续(MgSO，. 7H2) 0.5 g 水1000mL 制法z除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH值约6.O.煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为5.8土0.2.分装后置压力蒸汽灭菌器内115C灭菌30min，即得。A3 普通肉汤琼脂培养基(供细菌用平板及斜面)成分陈氯化销琼脂10 g 5 g 1520 g 191

49、GB/T 14233. 2-93 肉浸液1 000 mL 制法z取牛肉浸膏3g.加水1000 mL.配成肉浸液。将陈、氯化纳、琼脂加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2:1:0.2.分装后置压力蒸汽灭菌器内灭菌30min即得。附录B细胞培养液、消化液、平衡盐溶液制备(补充件)Bl 细胞培养液B2 消化液成分:Eagle培养液小牛血清青霉素G(2万单位/mLl硫酸链霉素(2万g/mLl成分:EDTA溶液(0.02%)膜酶溶液(0.25%)郎平衡盐溶液BSS)B3. 1 按表B1配方准确称量各种试剂。表B1试剂Earle榷NaCl 6.80 KCl 0.40 CaCl, 0.20 M