SN T 1907-2007 副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程.pdf

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1、s 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1907一2007副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程Protocol of the PCR for mycobacterium paratuberculosis 2007-05-23发布2007-12-01实施/苦:lr，+m也Z剿耐挝事如棉俑，黯伊中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准Iil结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程S:-l/T 1907-2007 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷

2、开本880X 1230 1/16 印张0.5字数7千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000也略书号，155066.2.18051 定价6.00元SN/T 1907-2007 前本标准的附录A和附录B均为资料性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位z中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人2巩红霞、廉慧锋、连庚寅、巩强、吴海军、雷雨平、李卫华、张祖维。本标准系首次发布的检验检疫行业标准.I 1 范围副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程本标准规定了副结核分枝杆菌PCR检测方法。本标准适用于牛、羊等反鱼动物的粪便及奶中副结核分校杆菌的检

3、测.2 规范性引用文件SN/T 1907-2007 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO 3696 , 1987) 3 试剂和材料3. 1 主要仪器3. 1. 1 PCR热循环仪。3. 1. 2 天平。3. 1. 3 超净工作台.3. 1. 4 消毒灭茵锅。3. 1. 5 高速冷冻离心机。3. 1. 6 低温冰箱，冷藏

4、冷冻冰箱。3. 1.7 实验用水制备装置。3. 1. 8 高温干燥箱。3. 1.9 旋涡振荡器。3. 1. 10 凝胶成像分析系统。3. 1. 11 恒温水浴振荡器。3. 1. 12 磁力搅拌器。3. 1. 13 微量移液器。3.2 主要试剂3.2. 1 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。3.2.2 实验用水g应符合GB/T6682中一级水的规格。所用试剂配方参见附录A，4 检测步骤4. 1 样品的制备4. 1. 1 标准菌株=副结核分校杆菌由国家质检总局指定单位提供。4. 1. 2 粪便z称取新鲜粪便1g.加3时_PBS(pH7. 4参见第A.5章).混匀，放置30min或300

5、r/min 室温离心5min，取上消液，室温放置30min或300r/min室温再次离心5min，取上清液.12000 r/min 室温离心15min，弃上清液，加人400LTE, 4. 1. 3 奶样z无菌操作取1mL奶加10LTriton X-I00.混匀.12000r/min室温离心15min，弃上清SN/T 1907-2007 液，管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦拌，加入400LTE. 4.2 DNA模板的提取4.2. 1 80C水浴加热20min，冷至室温。4.2.2 加50L溶茵酶(参见第A.2章)，37C气浴振荡培养1h. 4.2.3 加75LSDS/蛋白酶K(参见第A.3章)，混匀

6、，65C水浴加热10min. 4.2.4 加100L5 mol!L NaCl和100L65C预热5min的CTAB/NaCl(参见第A.4章)，上下颠倒混匀，直至液体变为白色(奶状)，65C水浴加热10min, 4.2.5 加750L三氯甲炕g异戊醉(241)，混匀，12000 r/min室温离心5mino 4.2.6 取上层水相于新管，加等体积的三氯甲tt.异戊醉(24 1)，混匀，12000 r/ min室温离心5min 4.2.7 取上层水相于新管，小心加入O.6体积的异丙iW沉淀核酸，小心手摇混匀，-20C放置30min, (Q.%且S院斗丰.00(4阳. 室温离中5min，弃上If液

7、.4.2.9 4.3 PCR法4.3. 1 伸3min，共33个循环。/主二4.3.2 PCR反应体系见表1，检测过刊哽设立阳性对，明、阴性对照和空气f照，用副结核标准商株的模板DNA作阳性对照，用其他非副结在菌的极权DNA放阴性对照，用水作空白对那模板。CR反应体系-_L.O出斗中J试剂名称贮备液浓度/飞、加入反应体系的体积/L。m:如i100m1!L Tris 飞10 X PCR Buffer(不吉MgH)1 2.5 (pH8. 氧化馁(MgCJ，) 25 mm I/L ., 1. 5 dNTP Mixture dATP dCTP、dGTP、dTP(各可2mol)1. 2.0 引物100

8、p 。I/ILf 各0.5Taq酶5 U/严t,J / 0.25 模板DNA f 2.0 ddH,O , 补足至反应总体积为25L注2反应体系中各试剂的盘根据反应体系的运体和、进行适当调整.,-,_-4.3.3 PCR扩增产物电泳检测取1.5g琼脂粉i，加人100mL电jjJc缓冲?在(参见第A.6章加热溶解，加入漠化乙绽至终浓度为1g/mL，制胶，将5L8L的Marker和PCR扩增产物分别与适景的加样缓冲液混合，点样.9 V/cm恒压，电t!)c40 min左右，凝胶成像分析系统检测并记录结果。5 结果判定及表述PCR后，阳性对照会出现一条400bp的D:lA片段，阴性对照和空白对照没有该

9、核酸带，待检样品中如出现400bp的DNA片段为检测结果阳性，即检出副结核分校杆菌。如未出现400坤的DNA片段为检测结果阴性，即未检出f，IJ结核分校杆菌。2 附录A(资料性附录)试剂配方SN/T 1907-2007 A.1 TE缓冲液，10mL 1 mol/L Tris(pH 8.0) , 2 mL O. 5 mol/L Na2EOTA(pH8. 0)，加水定容至1 000 mL.分装后高压灭茵备用。A.2 溶lil酶z用10mmol/L Tris(pH 8.0)配置成10mg/mL浓度，分装后20.C保存。A.3 SOS/蛋白酶K，在70mL 10% SOS rp加入5mL 10 mF;

10、/mL蛋白自fjK 昆匀即成。称取10g SOS 加入到90mL水中，加热到68C，磁力搅拌器助浴，滴加浓盐酸调pH到7.2，水定容至100mL，用灭茵的50mmol/L Tris(pH8. 0) ,1. 5 mmol/L乙酸钙溶解蛋白酶K，配置成浓度为10mg/mL的溶液，分装，一20C下保存。A.4 CTAB/NaCI.称取4.1g氧化纳(NaCD溶于80mL水中，缓慢加入10g CTAB，同时搅拌，完全溶解后，加水至100mL. A.5 PBS(pH7.4)，溶液A，O.2mol月，磷酸二氢的CNaH，PO.)(27.8 g溶于100mL水)，溶液B，0.2 mol/L磷酸氢二纳(Na2

11、HPO.)(53.65 g Na2HPO, .7H，O或71.7 g Na2HPO. 12H，O溶于100 mL水h取溶液A19.0 mL和溶液B81. 0 mL，混合后加入适盐水至终体积为200mL。A.6 电泳缓冲液(TBE)，Tris 54 g，朋酸27.5g , O. 5 mol/L EOTA(pH8. 0)20 mL，加蒸倒水至1 000 mL，使用时10倍稀释.SN/T 1907-2007 附录B(资料性附录扩增产物的参考序到GTTCGGGGCCGTCGCTTAGGCTTCGAATTGCCCAGGGACGTCGGGTATGGCTTTCA TGTGGTTGCTGTGTTGGATGGC

12、CGAAGGAGATTGGCCGCCCGCGGTCCCGCGACGA CTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGTCGGCGTG GTCGTCTGCTGGGTTGATCTGGACAATGACGGTTACGGAGGTGGTTGTGGCACAAC CTGTCTGGGCGGGCGTGGACGCCGGTAAGGCCGACCATTACTGCATGGTTATTAAC GACGACGCGCAGCGATTGCTCTCGCAGCGGGTGGCCAACGACGAGGCCGCGCTGCT GGAGTTGATTGCGGCGGTGACGACGTTGGCCGATGGAGGCGAGGTCACGTGGGCGA TCGACCTC SN/T 1907-2007 书号，155066.218051 定价，6元