SN T 1816-2006 番茄中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1816-2006 番茄中转基因成分定性PCR检测方法Method of polymerase chain reaction for detecting genetically modified components in tomato 2006-08-28发布061214000250 2007-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准番茄中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 1816-2006 中国标准出版社出版北京复兴门外三星河北街16号邮政编码，100045网址电话，68523946685

2、17548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数17千字2006年11月第一版2006年11月第一次印刷印数1-2000 书号，155066 2-17306 定价8.00元SN/T 1816一2006前本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人z陈颖、张样林、徐宝梁、高宏伟、王振国、王晶、吴亚君、黄文胜。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 1816-2006 番茄中转基

3、因成分定性PCR检测方法1 范围本标准规定了番本标准适用于商SAVR、BioScien等品2 规范性引用文件有的修改单(不包括勘误的内容)或修订3 术语、定义和缩畸3. 1 术语和定义3. 1. 1 转基因transgene 将本物种不具有的、来源于表达，以便使该物种获得新的3. 1. 2 聚合酶链反应模板基因序列先设计的两条引物分别的催化下以四种脱氧一循环，使欲扩增的基3.2 缩略语3.2. 1 Ca岛1V35S 35S 花椰菜花叶病毒35S3.2.2 、ZenecaB，Da , 282F、FLAVR。凡是注明日期的引用文件，其随后所，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研反应条件下，根据模板

4、序列结合，接着在DNA聚合酶重复变性、退火和延伸这FAM35S/HSP70 35S promoter from a modified figwort mosaic virus/O. 8 kb intron froJQ sp70 geneCheat-shock protein) 玄参花叶病毒启动子/热休克蛋白基因的0.8kb内含子序列。3.2.3 CMV Cucumber mosaic virus 黄瓜花叶病毒。SN/T 1816-2006 3.2.4 Ocs octopine synthase gene 章鱼碱合成酶基因。3.2.5 Nos terminator of nospaline sy

5、nthase gene 腼脂碱合成酶基因。3.2.6 mas mannopine synthase gene 甘露碱合成酶基因。3.2.7 NPTII neomycin-3-phosphotransferase gene 新霉素-3仁磷酸转移酶基因。3.2.8 PG antisense poJygaJacturonase gene 多聚半乳糖醒酸酶基因。3.2.9 ACCD(EFE) 1田aminocycJopropane-1-carboxyJicacid deaminase 1-氨基-环丙炕1竣酸脱氨酶。3.2.10 ACCS 1-aminocycJopropane- 1 carboxyJi

6、c acid synthetase l氨基环丙皖-1-竣酸合成酶。3.2. 11 CrylAc a synthetic gene encodes insecticidaJ-active truncated product identical to that of cryIA(c) gene of Bacillus thuringiensis subsp ,Kurstaki steain HD-73 苏云金芽于包杆菌杀虫毒蛋白。3.2.12 Sam-K S-adenosylmethionine hydrolase s腺昔甲硫胶酸水解酶。3.2.13 rbcS ribulose- 1, 5-bis

7、phosphate carboxylase small submit gene 植物叶绿体核酬糖1，5-二磷酸援化酶小亚基基因。3.2.14 rbcL ribulose- 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit gene 植物叶绿体核酣糖1，5-二磷酸楼化酶/加氧酶大亚基基因。3.2. 15 aad aminoglycoside adenyltransferase 氨基糖昔腺瞟岭转移酶。3.2.16 Tml 来自农杆菌的未命名蛋白。4 原理样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，

8、2 SNjT 1816一2006特异性扩增外掘基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。检测先对提取的DNA进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果。检测过程中防止交叉污染的措施按照SNjT1193中的规定执行。5 试剂5.1 PCR用引物按照表l中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成100pmolj t-tL贮存，配成直接用于PCR反应的20pmol/t-tL的工作液。表1检测转基因番茄内，外源基因所需的引物序列被检测基因基因来源引物序列扩增长度/bp 退火温度

9、/C备注bcL 叶绿体DNA5 cttgattttaccaaagatgatga 3 159 54 DNA提取效率检测5 ttcttcgcatgtacccgcag 3 PG 内源5 ggatccttagaagcatctagt 3 383 60 DNA提取效率检测5 cgttggtgcatccctgcatgg 3 5-tcatcccttacgtcagtggag-3 165 54 5年ccatca ttgcga taaaggaaa-3 筛选检测CaMV35S 外源(品系351N除外)5 gctcctacaaa tgcca tca 3 195 54 选择其一5 ga tagtggga ttgtgcgt

10、ca 3 5 gaatcctgttgccggtcttg 3 180 54 筛选检测5 tta tcctagtttgcgcgcta 3 (品系351N、8338和Nos 外源5 gccggtcttgcgatgattat 3 FLAVR SAVR除外)170 60 选择其一5 ttatcctagtttgcgcgcta 3 5-ggatctcctgtcatct-3 173 58 5-gatcatcctgatcgac-3 筛选检测NPTII 外源5 ctcaccttgctcctccgaga 3 选择其一215 54 5 cgccttgagcctggcggacag 3 CaMV35S/PG 外源5 cc

11、actgacgtaagggatgacg 3 383和180检测FLAVRSAVRTM 54 5 aggggaaagtggaaaaccatc 3 tomato PG/NOS 外源5 ggatccttagaagcatctagt 3 54 检测ZenecaTomato I 350 5 catcgcaagaccggcaacag 3 nema282F CryIAc 外源、5 gttccagctacagctacctcc 3 119 60 Tomato5345 5 ccactaaagtttctaacacccac 3 ACCD (EFE) 外源5 aaacagacaaaaataggcgg 3 5 ccaaac

12、gtaaaacggcttg 3 108 60 华番一号，8338a 转基因番茄可向时扩增出383bp和180bp两个不同大小的DNA片段，非转基因番茄只能扩增出383bp 的DNA片段。3 SN/T 1816-2006 5.2 药品及试荆5.2. 1 TaqDNA聚合酶，琼脂糖(电泳纯)澳化乙链，三氯甲烧，异丙醇，异戊醇70%乙醇，分子量标准(100 bp2 000 b肘，RNaseA酶，Tris饱和酣。5.2.2 TE缓冲液:10mmol/LTris- HClCpH8.0) , 1 mmol/L EDTACpH8.0)。5.2.3 10XPCR缓冲液:100 mmol/L氯化饵(KCl),

13、160 mmol/L硫酸镀(NH4)zS0420 mmol/L 硫酸镜CMgS04), 200 mmol/L Tris-HCICpH8.肘，1%TritonX-100，1mg/ mL BSA。5.2.4 电泳缓冲液:Tris 54 g，棚酸27.5g , O. 5 mol/L EDTA, Tris-HCICpH8. 0)20 mL，加蒸锢水至1 000 mL;使用时105.2.5 澳化乙链贮存5. 2. 6 dNTPs: dA 5.2.7 CTAB裂解5.2.9 O. 5 mol/L EDT ACpH8. 0 剧烈搅拌，用氢氧化铀调节溶压灭菌备用。5.2.10 3 mol/L乙pH值至4.80

14、6 仪器aCl) , 40 mmol/L琉基乙醇，于800mL水中，加入浓盐酸42mL, L，分装后高压灭菌备用。加水至1000 mL，用冰乙酸调E噩噩噩阴宿、伊，1!.:l:叭呢?那甜苦南惆岖固体粉碎机或研钵，高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机，天平(感量O.001 g)，旋涡振荡器，PCR仪，电泳仪，超净工作台，核酸蛋白分析仪，微量移液器，凝胶成像系统，离心管(Eppendorf管，1.5 mL5 mL) ，PCR反应管(200L57 检测方法7. 1 样品DNA的提取称取充分?昆匀的600LCTAB裂解液，室温后，加入等体积加入1/10体积的3m放置30min以上;40C

15、温，15000 g离心5mi 离子水或TE缓冲液洛也可用相应市售7.2 PCR扩增7.2.1 实验对照的设立每个样品应有2个平行实验，同时每次检测必须设立3个对照:一一分子量标准;离心管中，加入650C预热的o min混匀1次;取出冷却至离心15min;小心吸取上清醇或O.8倍体积的异丙醇，再醇时)或40CC加入异丙醇时)醇500L，洗涤沉淀两次，室挥发殆尽后，加入50L的去阳性对照，为包含要检测基因片段的转基因植物材料的DNA或包含要检测基因片段的阳性质粒DNA;阴性对照，非转基因番茄基因组DNA;4 一一空白对照(不含DNA模板)。7.2.2 PCR反应体系检测转基因番茄内、外游、基因的P

16、CR反应体系(见表2)。表2检测转基因番茄内、外源基因的PCR反应体系试剂名称10XPCR缓冲液MgC12 dNTP(含dUTP)Taq酶UNG酶引物DNA模板双蒸水7.2.3 PCR反应程序不同外源基因的具体扩调整。储备液浓度SN/T 1816-2006 50L反应体系加样体积/L5.0 5. 0 4. 0 0. 4 0. 4 1. 0 1. 0 2. 0 补至50L增型号的不同进行适当表3检测转基因番茄内、外源基因的PCR反应循环参数被检测基因bcL 94C PG CaMV35 S 94C NOS 94C NPTII 94C CryIAc 94C CaMV35S/ PG 94C PG/ N

17、OS 94C 5 min ACCD( EFE) 95C 10 mi n 7.3 PCR扩增产物的凝胶电泳检测94C 94 C 30 s ,58C 30 s , 72C 30 s 15 s ,60C 40 s , 72 C 60 s 30 40 终延伸72C 5 min 72C 5 min 72C 5 min 72C 5 min 72C 5 min 72C 5 mi n 72C 5 min 72C 5 min 72 C 5 mi n 称取2.0g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液(0.5X TBE)中，用微波炉加热溶解琼脂糖，冷却至550CSN/T 1816-2006 600C左右加入澳化乙键(EB

18、)至终浓度为O.5g/mL，制肢。在电泳槽中加入电泳缓冲液(0.5XTBE) , 使液面刚刚没过凝胶。将8L10LPCR扩增产物和2L加样缓冲液?昆合，点样。每行胶孔中选一个胶孔，在其中加入DNA分子量标记以判断PCR扩增产物大小。电压大小一般控制在3 V /cm5 V /cm，电泳时间约35min或者根据澳酣蓝的移动位置来确定，电泳结果用凝胶成像仪记录并保存。8 结果判断8. 1 判断提取的DNA质量使用内参照引物rbcL基因或PG基因片段设计的引物对番茄样品DNA提取液进行PCR扩增，阴性对照、阳性对照和待测样品均应被扩增出159bp或383bp的PCR产物;否则不能用于检测外源基因，应该

19、重新提取样品DNA。8.2 筛选基因的判定对番茄样品DNA提取液进行外源基因的PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小见表1)，则可初步判定待测样品中含有可疑的该外源基因，应进一步进行确证试验，依据确证试验的结果做出最终判断;如果待测样品中未出现相应PCR扩增条带，则可判定待测样品中不含有该外源基因。8.3 筛选检测和鉴定检测的选择对番茄样品中转基因成分的检测，可参考附录A的内容。首先筛选检测所有转基因番茄中都存在的NPTn基因，检测结果阴性，则直接报告检测结果;检测结果阳性，则检测CaMV35S启动子基因，若未检出CaMV35

20、S启动子基因，则可确定样品为品系351N，若检出CaMV35S启动子基因，则进一步检测其他外源目的基因，以确定为何种转基因番茄。9 确证实验确证实验方法按照SN/T1204中规定的方法执行。6 SN/T 1816-2006 附录A(资料性附录)商晶化的转基因番茄转入的外源基因的主要信息表A.l目的基因及其调控元件筛选基因及其调控元件品系名称备注启动子目的基因终止子启动子筛选基因终止子DNA plant technology corpora ton，美国1994CaMV 氨基环丙烧竣酸合年批准用予食品和饲1345-4 Nos Nos NPTII Ocs 35S 成酶(ACCS)料.1995年用于

21、种植。加拿大1995年批准用子饲料。s-腺昔甲硫胶酸水Agrtope Inc.美国351N 未知未知Nos NPTII Ocs 1996年批准用于食|解酶(Sam-K)品、饲料和种植。Bt毒素蛋白基因1987 Monsanto公司，CryIAc和氨基糖背大豆球美国1998年用于食taMV 腺嚓岭转移酶aadCaMV 5345 蛋白终NPTII Nos 品、饲料和种植。加35S (aad基因在植物中35S 不表达，仅用于重组止子拿大2000年用于饲料。质粒的筛选氨基环丙烧竣酸脱Monsanto公司，美国!FMV35Sj rbcS终CaMV 1994年批准用于食品8338 氧酶(ACCD)或乙烯N

22、PTII Ocs HSP70 止子35S 和饲料，1995年用于形成酶(EFE)种植。Zeneca Seeds，美国CaMV 反义多聚半乳糖隆CaMV 1994年批准用于食品B.Da, F Nos NPTII Ocs 和饲料，1995年用于35S 酸酶CPG)基因35S 种植，加拿大19叫l用于饲料。1994美国加利福尼亚基因公司育成Flavr口las启mas终止Savr，成为转基因植株FLAVR CaMV 反义多聚半乳糖醒动子(甘子(甘露商品化的首例。美国|Tml NPTII SAVR 35S 酸酶CPG)基因露碱合碱合成1994年批准用于食品成酶)酶)西哥于1995、日本于1997年用于饲

23、料。OONlt-mWFHZ SN/T 1816-2006 表A.1(续)目的基因及其调控元件筛选基因及其调控元件品系名称备注启动子目的基因终止子启动子筛选基因终止子BioScien 1995年通过中国农业(华番1CaMV 氨基环丙炕竣酸氧部专家鉴定，1996年CaMV 号，商品化酶(ACCD)或乙烯Nos NPTII Nos 获农业部农业生物基35S 35S 名:百日形成酶(EFE)因工程安全委员会鲜)批准。CaMV 黄瓜花叶病毒(Cu-CaMV 8805R cumber mosaic vi- Nos NPTII Nos 35S 35S rus，CMV)外壳蛋白侵权必究书号:155066 2-17306 定价:7G 8.00 争e版权专有SN/T 1816-2006