GB T 13648-1992 化学试剂 氨基酸测定通则.pdf

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1、中华人民共和国国家标准化学试剂GB 13648-92 氨基酸测定通则Chemical reagent General rules for the det町minatlonof amino acids 1 主题内容与适用范围本标准规定了氨基酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和灼烧残渣测定的通用方法。本标准适用于氨基酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用氨基酸的分析。2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备GB 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB 608.化学试剂氮测定通用方法GB 613化学试剂比旋光度测定通用方法GB 617化学试剂熔点范围测定通用方法

2、GB 6682 实验室用水规格GB 9008液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法GB 9741化学试剂灼烧残渣测定通用方法3一般规定3. 1 本标准中所用的水，在没有注明其他要求时，应符合GB6682中三级水的规格。3. 2本标准中所用试剂的纯度应在分析纯以上。3.3 本标准中凡层析测定时，氨基酸的R，值均应以在完全相同条件下的标准样品或工作标准祥品的R，值为判断标准，且每次测定时都不得省去作为判断标准的标准样品或工作标准样品。3.4 本标准中凡层析测定需做杂质限量检测时，应使用符合6.1. 2. 2条规定的工作标准样品。4 熔点测定按GB617之规定测定。氨基酸的熔点数值可参考附录B（参考

3、件）。5 比旋光度的测定按GB613之规定测定。氨基酸的比旋光度数值可参考附录B（参考件）。DL型氨基酸的比旋光度应控制在0土0.5范围之内。国家技术监督局1992-09-01批准1993-07 01实施258 GB 13648 92 6层析试验层析试验用于检测氨基酸的纯度及定性鉴别。所有氨基酸均应从下列方法中选择一种方法进行测定。6. 1 纸层析6. 1. 1 方法原理纸层析法是以滤纸为惰性支持物的一种层析法分离原理属分配层析的范畴，它利用不同溶质在静止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相（即流动相）两相溶剂间的不断分配而达到分离的目的。氨基酸经层析后，常用比移值（R，）来表

4、示各组分在层析谱中的位置。R，值按式（1）计算zR d, - f - d:. ( 1 ) 式中：R，一一比移值gd，一一溶质迁移距离，cm;dm一一流动相迁移距离，cm。在一定的条件下，同一氨基酸的R，值是一定的，但由于影响R，值的因素较多般都采用与标准物质对比，即根据试样与标准物质在层析谱中也值来进行鉴别，并可根据显色后杂质斑点的多少和色量来确定试样纯度。6. 1. 2 .试剂及材料5.1.2.1 标准样品纸层析和薄层层析用标准样品，纯度不小于99.5%。6. 1.2.2 工作标准样品须经标准样品验证，主体含量不应少于98.0%。1. 2. 3层析用纸层析用纸是指具有一定强度，质地均匀平整的

5、纯棉浆制成的滤纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着纹理方向移动。定性用的层析滤纸灰分须小于0.1%。一般可选用新华号层析滤纸。6.1.2.4 显色剂（常用显色弗lj)称取4g珩三嗣（苯骄戊三翩，溶于1000 mL乙醇无水中，置于棕色瓶内保存。市三酬除对脯氨酸和泾脯氨酸产生黄色外，其他氨基酸均产生紫色氨基酸的特殊显色剂可参照附录C（参考件。6.1.2.5展开剂展开开1J可参照附录A（参考件之规定使用前制备，必要时可选用其他展开剂。6.1.2.6 展开室可选用大小适宜的标本缸。6. 1. 3 操作步骤取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔J一直线，在直线两端2cm处开始点样，点与点之间距

6、离为2cm,J点样扩散的直径不超过0.5 cm.每点下面须用铅笔注明试样的名称和点样的量。同一张层析纸上可点数个试样，纸的宽度取决于试样的数目，并留有点标准样品或工作标准样品的位置。称取0.005 g氨基酸试样，精确至0.000 1 g.溶于0.5 mL水或盐酸椿液。（HCl)=O.5 mol/L中，稀释至5mL.用微量进样器或微量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不少于5 ！，不多于10L.J相当于50降和100降。氨基酸纸层析一般上行即可，可将已吹干的层析纸两边卷成圆筒状，用二根塑料丝.:tr固定。在一25臼GB 1364892 高为36cm的标本缸内平放一培养皿，内盛高度

7、为0.5 cm的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱和蒸气平衡2至4h后，试样端朝下放入培养皿中，盖紧玻璃盖。展开12至16h后，流动相前沿即可上升27至29cm，此时将层析纸取出晾干或50干燥，按6.1. 4条之规定显色6. 1.4 显色将已除去溶剂的层析纸喷以显色剂，冷风吹干后于5060保温1520min即可显出有色斑点。6. 1. 5 结果的确定s.1.5.1 以100问点样量，按规定展开并显色后，只显出一个斑点，旦与标准样品或工作标准样品的R，值一致即为层析试验合格。s.1.5.2 以100月点祥量，按规定展开并显色后，除显一个主斑点外，其他氨基酸的斑点小于或等于按产品规格规定制备的杂

8、质标准的斑点时，即可确定含其他氨基酸小于或等于标准。6-2 薄层层析6-2 1 方法原理薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。6. 2. 2试剂及材料6.2.2.1 标准样品应符合6.1.2.1条之规定。s.2.2.2工作标准样品应符合6.1.2.2条之规定a6.2.2.3硅胶G本品系白色均匀细粉，粒度平均在1040m之间，含有约13%的半水硫酸钙。本品应符合下列分离要求z各取0.040 g二甲基黄、苏丹E、肯定盼蓝，溶于100mL苯中。取2L，点祥于按6.

9、2.3.1条之规定制备的硅胶G板上，用苯展开10cm，色谱图应显示三个清晰的分离斑点，使盼蓝斑点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹E介于二者之间。s.2.2.4 纤维素粉（微晶形）本品为白色均匀细粉，平均粒度小于3m。本品应符合下列分离要求2各取0.025 g亮黑、鸡冠红、快黄、金莲橙，溶于100mL甲醇和水的混合溶液。1）中。取10L，点样子按6.2.3.1条之规定制备的纤维素板上，以丙醇乙酸乙酶水的混合溶液（10+1十4）为展开剂，上行10cm，色谱图应显示四个清晰的分离斑点，即黑色斑点、红色斑点，两个黄色斑点，R，值依次增加。s.2.2.5 展开剂应符合6.1.2.5条之规定。必

10、要时可选用其他展开剂。s.2.2.s 显色剂参照6.1.2.4条之规定。6. 2. 3操作步骤s.2.3.1 制板制备薄层板所用的玻璃板必须表商光滑、清洁，其大小可根据需要选择，小的可用载玻片，大的可裁成20cm 20 cm的玻璃片。取一定量的吸附剂硅胶G可按2530g加6065mL水s纤维素粉可按8g加48mL水、2mL 乙醇在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为0.2 0.3 m吨的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。硅胶G制板的时间从调糊状到铺板不应超过1.5 min 260 GB 13648 92 氨基酸及

11、氨基酸衍生物应使用在空气中干燥（不经过加热的薄层板。市售的预制板经6.2. 2. 3条或6.2.2.4条试验符合分离要求的亦可使用。6-2-3-2 点样和展层取薄层板一块，在距底边1.5 cm处开始点样，点与点之间的距离为1.5 cm，点样扩散的直径不超过0.2 cm o如需多次点样时，可用冷风将第一次点祥吹干后，再点第二次。试祥称取、榕解及点样用的器具应参照6.1. 3条之规定。薄层层析可选用大小适宜的标本缸。薄层板浸入展开剂的深度不超过0.5 cm，上行至流动相前沿离顶端。.Scm处（展开距离一般不超过15cm）取出，在50干燥除去溶剂。6.2.3.3显色将己除去溶剂的薄层板喷以显色剂，冷

12、风吹干后于50GOC保温1520min即可显出有色斑点。6- 2. 4 结果的确定应符合6.1. 5 . 1条及6.1.5.2条之规定。7含量测定氨基酸的含量通常可按下述两种方法之一进行测定7. 1 氮测定法按GB608之规定测定。本方法适用于全部氨基酸的含量测定。7-2 非水滴定法7. 2. 1 适用范围本方法适用于能溶于乙酸（冰醋酸）的具有碱性的氨基酸样品的含量测定，不适用于氨基酸盐酸盐样品的含量测定。7.2.2 试剂7.2.2. 1 高氯酸标准滴定溶液。（HCIO,)= o. 1 mol/L按GB601之规定制备。7.2.2.2 结晶紫指示液的制备称取0.20 g结晶紫，溶于乙酸中，用乙

13、酸（冰醋酸）稀释至100mL。7.2. 3 氨基酸含量测定按产品标准的规定，称取一定量的试样，精确至0.0001 g0置于干燥的锥形瓶中，加50mL乙酸溶解，加2滴结晶紫指示液（7.2. 2. 3），用高氨酸标准滴定溶液（7.2. 2. 1）滴定至溶液呈蓝绿色。同时做空白试验e含量按式（2）计算z(V1 - V,)c M w = m. X 100 .“”. ( 2 ) 式中，w一一氨基酸的含量，%；Vi佯品消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mL;v，一空白试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mL;C一一离氯酸标准滴定溶液的浓度，mol/L;M一一与1.00 mL高氯酸标准滴定溶液。（HCIO,)=

14、1. 000 mol/L相当的，以克表示的氨基酸的质量sm一一试样的质量，E。8 灼烧残渣按GB9741之规定测定。261 展开剂!. 正了醇十乙酸乙醇（无水）十水z. 仲丁醇甲酸（84%l水GB 13648-92 附录A常用氨基酸展开剂的组成和配比表（参考f牛）配比体积比）4+1+1+2 说纸层析常用展开剂15+ 3+2 明3. 正丁醇十甲基乙基丁隔十氨水水5+3+3十1纸层析分离苏氨酸和别苏氨酸的展开JiJ4. 仲T醇氨水（3%)15+6 纸层析常用展开剂s. 正丁醇十丙嗣二环己胶水10十10+2+s纸层析分离碱性氨基酸常用展开剂6. 正丁醇丙嗣二乙胶水10+10十2+s7. 异丙醇甲酸（

15、84%l十水40+2+10 薄层层析常用展开剂8. 苯毗睫乙酸8十20十29 A+B 3+7 A,P比睫十乙酸十水1十l十1.5 薄层层析分离氨基酸衍生物常用展开剂B，乙酸乙酣异丙醇10十410. 正丁醉乙酸水4+1十1附录B常用氨基酸的比旋光度和熔点（参考件表Bl中文名称英文名称缩写）阳对分子质到熔点，”熔解度比旋光度Ji-DL丙氨酸DLalanine(Ala) 89. 09 295d 16.6 L丙氨酸Lalanine(Ala) 89. 09 297d 16.65 A+ 14. 6 DL精氨酸DL-arginine(Arg) 174. 20 238d L精氨酸L-arginine(Argl

16、 I 7 4. 20 244d is. o A+27. 6 DL一、DL-asparagine (Asp NHl 132 12 213 215d 2 15 (Asn) L-JC守L-asparagine (Asp NHl 132. 12 236d 2.989 LC28.6 (Asn) （水合物）L天每氨酸L-aspartic acid(Asp) 133. 30 269 271 o. 5 AJ+zs.4 I，瓜氨酸L-citrulline (Cit) 175. 19 234 Z37d 易溶A个24.2L半眈氨酸L-cystine(Cys) 121.15 易溶A+6. 5 fJL眈氨酸DL-cys

17、rine (Cyss) 240.29 260 o. 004 9 ！.脱氨酸L cystine(Cyss) 240.29 258 26ld 0 Oil A-232 262 GB 13648 92 续表Bl中文名称英文名称（缩写）阳对分子质量熔点，川溶解度2比旋光度咱DL谷氨酸DL glutamk acid(Glu) 147. 13 225 227d 2.054 L谷氨酸L-glutamic acid(G!u) 147.!3 247 249d 0.864 A+3!. 8 L谷L glutam;ne (Glu NH) 146. 15 184 185 4-25 (Gin) A+31. B 甘氨酸Gly

18、cine(Gly) 75.07 292d 24.99 I丑，组氨酸DLhistid;ne (His) 155. 75 285 286d 易榕！.组氨酸L-h;st;d;ne(H;s) 165.16 277d 4. 16 BJ 38. 5 L-hydroxyproline (Pro OH) 131. 13 270d 36. 11 LA50.5 (lyp) BJ 76 DL异亮氨酸DL-isoleucine (Ile) 131. 17 292d 2.229 I，异亮氨酸I.-isol eucine (lie) 131. 17 285 286d 4. 12 A十30.5DL亮氨酸DL-leucine

19、(Len) 131. 17 332d 0 991 . L-leucine (Len) 131. 17 337d 2. 19 LAJ+l6.。,. BJ-11.0 . DL赖氨酸DL-lysine(Lys) 145.70 L lysine(Lys) 140. 19 224d 苦苦LAzs.g B+13.5 DL甲硫氨酸DL-methionine(Met) 140 21 281 3.38 （蛋氨酸I. L rnethionine(Met) 140. 21 288d LAJ串啤2 . B-10.0 DL 口L-phcnylalanine(Phe) 165-19 318 320d 3.42 165-1

20、9 283 284d 2-96 LB34.5 L phcnylalanine(Phe) DI.脯氨酸DL-proline (Pro) lJS. 13 213 易溶J. Lproline(Pro) 115. 13 220 222d 162.3 LA60.3B-86.2 DL丝氨酸DL-serine(Ser) 105.09 246d so. 2 Lserine (Ser) 105.09 223 226d 26 tA1+1s.1 BJ一7.5 DL苏氨酸DL-threonine(Thr) 119. 12 235分解点20. 1 L if Lthreonine (Thr) 219. 12 253分LA

21、J-15.0 B-28.5 DL- DL tryptophane(Trp) 204. 22 283 285 0 25 Ltryptophant (Trp) 204.22 281 282 1. 14 LAJ+2.8 ，、, BJ 33. 7 DL醋氨酸DL-tyrosine(Tyr) 181-19 316 o. 035 l I，酶氨酸L-tyrosine (Tyr) 181-19 342. 4d 。.045 A一10.0时，绩氨酸DL yaline(Val) 117.15 293d 7.04 263 GB 13648-92 续表Bl中文名称英文名称（缩写F雨而eTVaf)对分子质蚓熔点，溶解度I

22、 比旋光度吨aJi 117.15 I 315d I 8 85飞川I LAJ+2电，3B+5. 63 注1) d代表达到熔点后分解。2）在25于100g水中榕解的质量特殊的温度条件则注明在右上角3) A加50200mg试样于10mL15%盐酸中；BJ加50200mg试样于10mL水中；C加951.9 mg试样于10%盐酸中C1 甘氨酸显色剂c1. 1 试剂附录C氨基酸的特殊显色？”（参考件）试剂甲称取0.20.g邻苯二甲醒，溶于100mL丙翻中。试剂乙z称取1.0 g氢氧化饵，溶于100mL95%乙醇中。c1. 2 显色把层析纸在试剂甲中浸拉后，于100干燥，再于试剂乙中浸拉，于100干燥10m

23、in。甘氨酸显绿色。C2酷氨酸显色剂c2. 1 试剂试剂甲g称取0.10gl亚硝基2荼盼，溶于100mL乙醇溶液（75%）中。试剂乙g量取15mL硝酸，稀释至100mL。c2. 2 显色层析纸上先喷试剂甲，吹干后，再喷试剂乙，100保温3min0酶氨酸或含酷氨酸的多肤显红色，其底色为浅绿色，放置30min后斑点转为桔红色，其后渐褪去。C3组氨酸和酷氯陋的显色Jc3. 1 试剂试剂甲：称取4.50 g对氨基苯磺酸，加45mL盐酸，加热溶解，稀释至500mL。在0将此溶液与等体积的亚硝酸销溶液（50g/L）混合。试剂乙碳酸纳溶液（100g/L）。c3. 2 显色层析纸上先喷试剂甲，片刻后再喷试剂乙

24、组氨酸显桔红色，酶氨酸显红色C4 丝氨酸和姬鹏氨酸的显色1f!Jc4.1 试剂试剂甲：称取6.75 mg高腆酸销，加甲醇溶解，加2滴盐酸溶液（2%），用甲醇稀释至100mL, 试剂乙：称取15.0 g乙酸馁，加o.3 mL乙酸（冰醋酸，加1mL乙酸丙酬，用甲醇稀释至100mL。C4. 2 显色264 GB 1364 8 92 层析纸上先喷试Jl1J甲，近干后再喷试剂乙，室温放置2h。在紫外灯（波长254340nm）下照30 min，丝氨酸和短脯氨酸都显黄色，并都具有荧光。C5 精氨酸显色剂c5. 1 方法一试剂甲：称取5.0 g尿素，溶于100mL荼盼乙醇溶液（0.1 g/L）中。按每100m

25、L溶液加3日氢氧化惆于使用前制备。试剂乙取o.7 mL澳水，加100mL氢氧化纳溶液（50g/L），混匀。cs. 2 方法二试弗jljl z称取o.10 g 8经基噎琳，溶于100mL丙翻中。试剂乙：取1mL漠水，加500mL氢氧化纳溶液（20g/L），混匀。C5. 3 显色方法一和方法二均先喷试剂甲，吹干后再喷试JfJ乙，精氨酸显红色斑点。C6 踊氨酸C6.1 试剂称取1.0 g呵噪酶、1.50 g乙酸镑，加lmL乙酸（冰醋酸）、5mL水及95mL异丙醇混合溶解。C6. 2 显色层析纸上喷此显色剂后，在8085C保温30min.脯氨酸显蓝色，以30温水洗去多余的显色剂后，背景为白色或浅黄色。C7色氨酸C7.1 试剂称取1.0 g对工甲氨基苯甲醒，溶于95mL95%乙醇中，加5mL盐酸，混匀。C7. 2 显色层析纸上喷此显色剂后，吹干，色氨酸显紫色附加说明：本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由北京化学试剂总厂归口。本标准由中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司负责起草本标准主要起草人陆之贤。265