DB11 T 376-2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范.pdf

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1、 ICS 65.150 B 50 备案号： 19167-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 376 2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 Rules of epidemic quarantining and prevention for familiar disease of cultured fish 2006-07-25发布 2006-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 376 2006 I 前 言 本标准为常见鱼病防疫检疫技术操作规程。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准起草单位：北京市农业局水产办公室。 本标准主要起草人：李继勋、杨华

2、莲。 DB11/T 376 2006 1 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 1 范围 本标准规定了常见养殖鱼类的病害防疫检疫技术操作规范。 本标准适用于北京地区淡水养殖鱼类疾病的防疫检疫和管理。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包 括勘误 的 内容）或 修 订版均 不适用于本标准， 然 而， 鼓励根据 本标准 达 成 协议 的 各方研究 是 否可使 用 这些 文件的 最新版 本。凡是不注日期的引用文件，其 最新版 本适用于本标准。 GB ll607 渔 业水 质 标准 GB/T 15805.1-1995 淡水鱼类

3、检疫 方法 第一部分 GB/T 18407.4-2001 农产 品安全质量 无 公害水产 品 产地 环境 要 求 NY 5070-2002 无 公害 食品 水产 品 中 渔药残留限量 NY 5072-2002 无 公害 食品 渔 用 配合饲料安全限量 NY 5171-2002 无 公害 食品 渔 用 药物使 用准 则 DB11/T 196-2003 常见鱼病防 治 技术操作规程 3 防疫调查 3.1 养殖的环境调查 3.1.1 周围环境 根据 GB/T 18407.4要 求 的 各项指 标 进行调查 。 3.1.2 养殖水源 调查 养殖用水 来源 和 进排 水。 根据 GB 11607各项 水

4、 质指 标 调查 水 质 的 情况 。 3.1.3 养殖水体 调查 养殖水 体形状 、 面积 、水 深 、 底质及 水 化因子情况 。 3.2 养鱼史调查 调查 养殖鱼类 发生 鱼病的病 原 类 型 、 发生频率 、 药物 的 使 用 情况 （包 括药物种 类、成 分 、用 量 和 施 用 次数） 。 调查放 养鱼 苗 、鱼 种 产地病 史 、检疫和 药物使 用 情况 。 3.3 水质监测 3.3.1 气温和水温 采 用水 银温度计 、 酒精摄氏 温度计 、 电 子 仪器测 量 ， 测 量 时 要注 明当天 的 气象 情况 。 3.3.2 水色和透明度 透明 度采 用 透明 度 板 进行 测

5、量 ，通过 目测观察 养殖水 体 的水 色以判断浮游 生物 的 种 类和 数量 。 3.3.3 水体 pH值 采 用 PH试纸 、 比色测 定 计 、 电 子 酸 度计进行 测 定。 3.3.4 溶氧 使 用 碘 量法 测 定养殖水 体 的 溶氧 量 。 3.4 化学物质测定 根据 GB 11607要 求 的水 质指 标和 方法进行分 析 。 3.5 池塘清整方法 3.5.1 清塘方法 DB11/T 376 2006 2 调查 清塘消毒 方法 （是 干塘清塘消毒 法或 带 水 清塘消毒 法） 和 清塘 程 度 ，包 括 淤泥 的 清 理程 度 、 排 水、 除杂以 及 塘基 修 复 情况 。

6、3.5.2 清塘消毒药物 根据 NY 5171提 供 的 药物进行 清塘 。 调查内容 包 括 清塘消毒时间 、 各种药 剂名称 、用 量 、 效果 及 消 毒时 的操作 方法 的 调查 。 3.6 饲养管理情况调查 包 括 饵 料来源 、 种 类、 投喂 方法 、水 质 管理和 平时 疾病 预 防 方法 等 内容 。 4 病原体的检查 首先确 定检 测 的鱼 品种 名 ，检 测器官 部 位、病 变 程 度 ，所 取 标本的 情况 ， 再 通过 目 检、 显微镜 检 查 、 病 毒学 检 测 、 细菌学 检 测 检 查发 病 原因 和 初步确 定病 原体 的 种 类。 4.1 检测及分类 4.

7、1.1 目检 根据 症 状 通过 目 检 法 初步判断 病 因 和 原 病 种 类。主要有 寄 生 虫 病、水 霉 、 原生 动 物 、 蠕虫等； 根据 病鱼的 外表反应初步判断 和 辨别 病 毒 和 细菌性 病 原体 。 4.1.2 镜检 采 用 放 大镜 、 解剖镜 、 光学显微镜等 检 查法 。 4.1.3 分离、培纯以及感染试验 采 用 镜 检 方法 对微 生物 性 病 原 、病 毒 、 细菌 进行 检 测 ， 如对微 生物 性 病 原 、病 毒 、 细菌 的 细胞 形 态 、 培 养 特征 、 生 理 生化 反应等 进行 观察 、 测 定， 需 要 进一 步 进行分 离 、 培 纯

8、以 及 感染 试 验 。 4.2 寄生虫类病原体检查 对比 较 大 的 寄 生 虫性 病 原体 ， 宜 用 放 大 倍 数 低 的 显微镜 或 双筒 解剖镜 检 查 。 4.2.1 玻片下观察 把从 器官 或 组织上 分 离 出的 较 大 的 寄 生 虫 直接 放 在小玻璃皿 或 玻片上 观察 ， 对 较小 的 寄 生 虫 要 把 寄 主的 器官 组织 或内 含 物 压 成 薄层 后 进行 观察 。 4.2.2 镜检 4.2.2.1 检 鳃 从每 一 侧鳃 的 第一 片鳃片接近两端 的位 置 取 鳃组织 。 4.2.2.2 检 口腔 先 用 目 检 方法 观察 鱼 体 表 面 确 定有 无 吸

9、 虫 的 大胞 囊 、 锚头藻 等 ， 再 用 镊 子 刮 取 上 下 颌少许粘液 进行 镜 检。 4.2.2.3 检体 腔 将 鱼 腹 剖 开 ， 将 器官 暴露 ， 观察 脂肪组织 、 肝 、 胆囊 、 脾 等 有 无 肉眼 可 见的病 原体 。 如 发 现 有 白点 ， 可 能 是 粘孢 子 虫 或 微 孢 子 虫 。 还 可发 现线 虫 、 绦 虫 、 棘头 虫等 成 虫 和 囊蚴 。 目 检 完毕 后， 把腹腔液 用 吸 管 吸 出， 置 于 培 养 皿里 进行 检 查 。 4.2.2.4 检 脂肪组织 通过 目 检 胃肠 外 壁 的 脂肪组织 ， 如果 发 现白点 ， 肉眼 无法

10、判断时 ， 可 用 镊 子 取 出， 压片 进行 镜 检。 4.2.2.5 检 胃肠 先 把肠 外 壁 的 脂肪组织剔净 ， 然 后 在前肠 (胃 )、中 肠 和后 肠三段上 各 取 少许 ， 滴上 生 理 盐 水 进行 镜 检。 对寄 生部 位 比 较固 定的 寄 生 虫 ， 如 通常 寄 生 在 后 肠近肛门 的位 置 的 六鞭毛 虫 、 变 形 虫 、 肠袋 虫等 ， 通常 寄 生 在前肠 (胃 )或 中 肠 的 复 殖 吸 虫 、 绦 虫 、 线 虫 和 棘头 虫等 。 4.2.2.6 检 肝 和 脾 先目 检 肝 、 脾 外表 颜 色 和病 灶 ，有 无 溃 烂 、病 变 、 白点

11、和 肿瘤 等 。 如 有 白点 ， 可 能 是 粘 袍 子 虫 或 者 微 袍 子 虫 、 球 虫 。 然 后用 镊 子 从肝 、 脾上 取 少许组织压片 镜 检。 DB11/T 376 2006 3 4.2.2.7 检 胆囊 把胆囊完 整 取 出后， 放 入 培 养 皿 中， 先 通过 目 检 观察外表 颜 色 和 可 疑 的疾病 症 状 ， 然 后 剪 开 ， 放 出 胆 汁 ， 取 一部分 胆囊壁 放 在 载 玻片上压片 进行 镜 检。 4.2.2.8 检 心脏 用 小 剪刀剪 开 胸 腔 ， 取 下 心脏 ，并 将 心脏剪 开 ， 取 一 滴 内 含 物 ， 进行 镜 检，检 查 是

12、否 有 锥 体 虫 、 隐 鞭 虫等 。 同 时取 心脏 组织少许 用 玻片压 展 法进行 镜 检。 4.2.2.9 检 鳔 取 鱼 鳔 时 保持鳔 的 完 整 ， 观察 其 外表 ， 然 后 剪 开 ，检 查 有 无 复 殖 吸 虫 、 线 虫 。 同 时取 鳔 组织少许 用 玻片压 展 法进行 镜 检。 4.2.2.10 检 肾脏 把 整个肾脏 完 整 地 取 出。检 查方法 同 4.2.2.6。检 查 有 无 粘孢 子 虫 、 球 虫 、 锥 体 虫 、 隐 鞭 虫 ， 复 殖 吸 虫 、 线 虫等 幼 虫 。 4.2.2.11 检性 腺 和 膀胱 将 左右 两 个 性 腺 完 整 取

13、出， 进行 目 检。 没 有 膀胱 的鱼， 则 检 查 输尿 管。 4.2.2.12 检 眼 把完 整 的鱼 眼 睛 放 在玻皿 或 玻片上 ， 剖 开 巩膜 ， 放 出 玻璃 体 和水 晶 体 ， 进行 镜 检，检 查 寄 生 在眼 睛 的 吸 虫 幼 虫 。 严重 感染吸 虫时 ，水 晶 体 变 白 色 ， 混浊 不 透明 ， 致 使 鱼 眼 失 明 。 4.2.2.13 检 脑 按 水 平 方 向 ， 从 后 向 前 ， 在 后 脑 和 眼 睛之 间 剪 开头 盖骨 上壁 ， 即 见 到充满着 淡 灰 色 泡沫 状 的 油 脂 物 质 ，用 吸 管 把 它 吸 出， 放 在玻皿里 ， 以

14、 备 检 查 。 吸净 油 脂 物质 后， 灰 白 色 的 脑即 显 露 出 来 ，用 剪刀 把 它 完 整 地 取 出 来 检 查 。 4.2.2.14 检 脊髓 从头 部 与躯 干 交 接 处 把 脊柱骨剪 断 ， 再 把 身 体 的 尾 部 与躯 干 交 接 处 的 脊柱骨也剪 断 ，用 镊 子 从前端 的 断 口 插入脊髓 腔 ， 把 脊髓夹住 ， 慢慢 地 把 脊髓整 条 拉 出 来 ， 然 后检 查 。 4.2.2.15 检 肌肉 从 身 体 的 一 侧 面 剖 开 一部分 皮肤 ，用 镊 子 把 皮肤剥去 ， 或 用 小 棍棒 (玻 棒 或 竹棒 )， 象 卷 纸 筒 一 样 ，

15、 慢慢 地 把 皮肤卷剥 。 剥去皮肤 后， 肌 肉 即 露 出 来 ， 经 目 检后， 再 进行 镜 检。 4.3 原生 动 物病原体的 计数 原生 动 物 不 同 种 类 个 体 大 小 差异 大 ， 除 纤 毛 虫 、 毛 管 虫以显微镜 低倍 视野 为单位 之 外 ，其 他 种 类 如 鞭毛 虫 、 变 形 虫 、 孢 子 虫 均 以显微镜 的 高 倍 视野 为单位。 寄 生 虫 或 病 原体数量 用 “十 ”号 表 示 ， “十 ” 表 示 有 ； “ +” 表 示多 ； “ +” 表 示很多 。 必 要 时 可 用文 字描述 。 具 体 表 示 法 :在 一 个视野 里 ，有（ 1

16、-20） 个 虫 体 记 “十 ” ，（ 21-50） 个 虫 体 记 “ +” ， 51个 虫 体 以 上 记 “ +” 。 关 于 胞 囊 的 计数则 用文 字说 明 。 4.4 单 殖 吸 虫、 线 虫、 绦 虫、 棘头 虫、 甲壳动 物和 软 体 动 物 幼 虫的 计数 在 50个 以 下 均 以 数 字说 明 ， 50个 以 上 则 说 明 估 计数 字 或 者 部分 器官 里 的 虫 体数 。 4.5 检查 时所 用的 显微 镜的 倍数 显微镜 倍 数 都 应 注 明 ， 低倍 显微镜 为 10倍 ； 高 倍 显微镜 为 10倍 40倍 。 微 型 病 原体数量 的 计 算 ，是

17、以 同 一 玻片 中 观察 的 平 均数 为准。 5 病原体的 收集操作 对 需 要通过 详 细观察 其 形 态 结构才 能 鉴 定和 需 要 进一 步 研究 的病 原体 ， 应 做好 其标本的 收集 、 固 定 和 保 存 。 5.1 病毒 DB11/T 376 2006 4 收集 病 毒性 病 原体 标本， 应 在 无 菌 操作下 收集 发 病 早 期的病鱼 带毒 最 多 的 组织 器官 ， 保 证 病 毒 不 致 灭活 。 5.1.1 病毒 材料 的 收集 取 出病 变 的 器官 组织置 于 无 菌器 皿 中， 然 后 置 于 50%的 磷 酸 缓冲甘 油 中。注 明 收集 地 点 、日

18、期和 寄 主 种 类。 实 验 室 距 现 场 较近 ， 可 以 直接 检 测 ， 若实 验 室 距 现 场 较 远 ， 需把 病鱼 或 病鱼 器官 组织 放 入 有 冰 块 的 保 温 瓶 中， 快速运往实 验 室。 保 存 温度 在 -2O 50 。 5.1.2 病毒的分离培养 由于病 毒 只 能在 活 的 组织 细胞 中 繁 殖，鱼类病 毒 分 离 培 养 应 通过 组织 培 养。 5.1.3 病原 悬液 的 制 备 将 保 存 在 50%缓冲甘 油 的标本 (样 品 )，用 无 菌 生 理 盐 水 冲洗 3次 ， 如 是 新 鲜收集 的 器官 组织 材 料 ， 测 量 重 量 后，用

19、剪刀剪 碎 ， 按样 品 重 量 加 入 适 当比 例 的 缓冲 生 理 盐 水 (比 例 为 1:10至 1:20)，用 匀浆 器 或 乳钵 将 样 品研 成 乳 状 ， 以 3000转 /min速 度 离 心 20min， 吸 取 上 清 液 ， 按 体积 1ml加 入 青 霉 素 800国际 单位、 链 霉 素 800 g， 在 30 左右处 理 2h， 然 后于 5 保 存 备 用。 将离 心 后的 上 清 液 ， 经 滤 器 过 滤 除菌 ， 滤 液 保 存 备 用。 5.1.4 鱼体 造 病感染 采 用注 射 或 浸 泡 两 种方法 ， 同 时 设 对 照 组 观察 。 5.1.4

20、.1 注射 感染 将 病 原 悬 液 配 成 一 定 浓 度 ， 从 鱼 体 腹 鳍 基 部进行 腹腔 注 射 ，用 量 视 鱼 体 的 大 小 而定，通常 每 尾 注 射 0.2ml 0.4ml。注 射 后 放 入 水 族箱 中 饲 养， 维 持 发 病水 温 ， 观察 发 病 情况 。 5.1.4.2 浸泡 感染 将 病 原 悬 液 和 无 氯自 来 水 稀释 成 一 定 浓 度 ， 将 健康 鱼 放 入 其中 浸 泡 30min后， 移至 水 族箱 中 饲 养， 维 持 发 病水 温 ， 连续 观察 鱼的 发 病 情况 。 5.1.5 细胞 培养 与 感染 采 取 组织 培 养的 方法进

21、行 病 毒 的 分 离 、 培 养， 制 备 纯净 的病 毒 抗 原 ，通过 血 清学试 验 (如 中和 试 验 ) 与 感染 细胞 的 特 异 变 化来进行 病 毒 的 鉴 定和 抗血 清效 价 的 滴 定 等 。 5.1.6 原 代细胞 培养 选择健康 鱼， 在 无 菌 操作下 解剖 ， 取 出 组织 ， 置 于 盛 有 EarIe氏平 衡 盐 溶 液 的 无 菌培 养 皿 中，用 镊 子 小 心 除 去 附 着 的 组织 和 血块 ， 然 后 移 入 瓶 中，用 Earle氏 液 洗 涤 2次 ， 将组织 剪 碎 ，成为 约 lmm大 小 的 组织 块 ， 再 用 Earle氏 液 洗

22、1次 ， 加 入 相 当 于 组织 量 10倍 (约 1份 组织 加 入 9份胰酶 )的 25%的 胰酶 ， 在 25 消 化 20min 30min， 消 化 完毕 ， 弃 去 胰酶 液 ，用 Earle氏 液 清 洗 2次 ， 然 后 加 入 Eagles生 长 液 (Eagles 液 加 入 10%小 牛 血 清 、 青 霉 素 100单位 /ml、 链 霉 素 100 g /ml，用 5%NaHCO3， 调 节 pH7.2 7.4)，用 吸 管 反复 吸 吹 ， 以 助 细胞 分 散 ， 静 置片 刻 ， 让 没 有 分 散 的 大 颗粒沉 下， 然 后 吸 取 上层 的 细胞 悬 液

23、 ， 稀释 成 100 万 单位 /ml的 浓 度 ， 接 种 入 培 养 瓶 (若 采 用 青 霉 素瓶 作 培 养 瓶 ， 则 每 瓶 分 装 1毫升 即 可 )， 盖 紧 瓶 塞 ， 置 温 箱 内 (温 水 性 鱼类 可 在 22 28 )培 养。 每 隔 3d 4d更换 培 养 液 1次 ， 逐 日 在 显微镜 下 观察细胞 生 长 情 况 。 Earle氏溶 液 配方 见 附 录 A。 5.1.7 病毒 接种 选 取 生 长 均 匀 的单 层 细胞培 养 物 ， 在 无 菌 操作下， 吸 出 细胞 瓶 内 旧 的 培 养 液 ， 以 Earle氏 液 清 洗 细 胞 1次 ， 然

24、后 接 种 入 上 述制 备 好 的病 原 悬 液 (青 霉 素瓶 可 接 种 0.2ml 0.4ml)， 在 28 吸 附 30min 60min， 然 后 弃 去 瓶 内 的病 原 悬 液 ， 加 入与 原来 培 养 液 等 体积 的 维 持 液 (即 Eagle液含 2% 6%小 牛 血 清 、 青 霉 素 100单位 /ml、 链 霉 素 100 g /ml， pH 7.2 7.4)， 置 于 28 的条件下 培 养， 在 显微镜 下 逐 日 观察 细胞 病 变 。 不 同 病 毒应 按 照 不 同 的病 毒 接 种方法进行 。 5.1.8 病毒 株 的 保存 5.1.8.1 低 温

25、冷冻保存 DB11/T 376 2006 5 若 在 短 期 内使 用 , 应 将含 有病 毒 的 细胞培 养 液 或 含 有病 毒 的 组织 器官 暂 时 保 存 于 -20 -80 的 低 温 冰箱 或 液 氮 中。 材 料 应 贴 好 标 签 ，注 明毒 株 名称 、 代 数及 日期。 5.1.8.2 真空干燥保存 长 期 保 存 病 毒 活 力 可采 用 真空 干 燥 方法 。 但 应 使 用适 宜 的 保 护 剂 制 备 病 毒 的 悬 液 ， 保 护 剂 有 正 常 灭 活血 清 、 卵 白 和 卵黄 、 蔗糖饱 和 液 等 。 5.2 细菌 5.2.1 细菌 类病原体标 本 的

26、收集 取 得 病鱼标本后， 应 立 即 送 往实 验 室 进行分 离 。 在 野 外 调查 的 流 动 条件下， 或 离 实 验 室 较 远 ， 可采 用 如 下 方法 将 病鱼标本 暂 时 保 存 。 冰块 法 将 病鱼 (要 取 未死 或 刚死 的病鱼 )放 入 盛 有 冰块 的 瓶 里 ， 然 后 送 实 验 室 进行 病 原 菌 分 离 。 棉拭子 法 如果 是 血 液 或分 泌 物 等 ， 宜 采 用 棉花团擦抹患 病的 部 位， 然 后 将 抹 有病 患 部 位 含 有 物 的 棉拭 子 送 往实 验 室。 5.2.2 分离培养 用 浸 过 70%酒精 的 纱布覆 盖 病鱼 体 表

27、 ， 进行 鱼 体 表 面 消毒 后， 取 少许 病 灶 部 位 组织 ， 接 种 于适 当 的 培 养 基 使 之 生 长 ， 或 直接在固 体 平板培 养 基 中 划 线 分 离 。 分 离 后 挑 选 单 个 菌 落 进行 培 养。 5.2.2.1 分离 内部器官 如 肠 、 肝 、 肾 等 则 用 无 菌 手 术 法 剖 开腹 部 后，用 灼热铁 片 烫 后 再 用 接 种环 取 出 进行 材 料分 离 。 5.2.3 采心血 在 心 房 处 烫 过的 部 位， 以 无 菌 接 种 针刺 入 ， 然 后 接 种 在 培 养 基 上 进行分 离 。 5.2.4 人工 感染试验 人 工 感

28、染 的 接 种方法 有 浸 泡 、口 服 、注 射 、 涂抹 等 。 例 如 鱼 体 表 面 的病 症 可采 用 浸 泡 、口 服 、注 射 等 方法 。 多 次 反复试 验 (包 括 再 分 离 再 感染 )后， 根据 其出 现 的病 症 ， 判断 所 分 离 的 细菌 是 否 具 有 致 病 性 ， 并 根据 菌 落 形 态 和 培 养 特征 、 生 理 生化 反应测 定病 菌 的 分 类位 置 和 名称 。 5.3 水生 真菌 对 真 菌菌 丝 体 外 部形 态 特征 进行 目 检， 初步判断 真 菌 病 原体种 类。通过 实 验 室 培 养， 鉴 定其 种 类。 5.3.1 培养方法

29、采 用 培 养 基 ，通过水 生 真 菌 的 无 性 繁 殖， 使 它 的 孢 子 以 及 菌 丝 在 培 养 基 上 长 成 新 的 菌 丝 体 。 5.3.1.1 大麻子 仁或 大 麦等 制作 培养 基 : 将 大 麻 子 仁煮沸 消毒 后， 选 取 吸 水 饱 满 的 大 麻 子 仁 2粒 3粒 ， 放 入 盛 有 无 菌 水的 培 养 皿里 ，并 使 每 粒 大 麻 子 仁互相 间 隔 有 一 定 距 离 ， 以 利 菌 丝 充 分生 长 。 如果 没 有 大 麻 子 仁 ， 可 用 大 麦 、 小 麦 或 糯谷代替 。 5.3.1.2 鸡蛋黄 制作 培养 基 将 鸡 蛋 煮 熟 后，

30、 取 蛋 黄 ， 放 入 已 消毒 的 烧杯 中， 盖 上 盖 子 ， 取 米 粒 大 小 的 蛋 黄粒 ， 置 于 盛 有 无 菌 水 的 培 养 皿里 。 5.3.1.3 动 物 尸 体 制作 培养 基 将 动 物 尸 体 用 蒸馏 水 冲洗 数次 后， 在 解剖镜 下 选 取 所 需 要的 部 位， 置 于 盛 有 无 菌 水的 培 养 皿 中。 如 苍蝇 以 及各种 水 生 昆 虫 的 腹 部 和 附 肢 ， 都 可 作为 培 养 基 。 5.3.1.4 鱼 卵 制作 培养 基 取 各种 鱼 卵 ，用 60 80 的 热 水 浸 泡 10min， 使 鱼 卵 失去 活 力 ， 然 后

31、取 出 放 入 盛 有 无 菌 水的 培 养 皿 中 备 用。 消毒 处 理后 可 作为水 生 真 菌 的 培 养 基 。 5.3.2 接种 法 按 生物 学 规定的 接 种法进行 操作。 6 病原体标 本 的 保存操作 DB11/T 376 2006 6 6.1 培养 基 保存 法 在 菌 种 较少 又 经 常 使 用 时 ， 保持 其条件不 变 者 可采 用 此 法 。由于 培 养 基 的 物 理 化 学性 质因 细菌 的 代 谢 而 发生 变 化 ， 影响 细菌 的 性 状 ，而 且 操作 麻 烦 ， 需 要不 断 地 多 次 传 代 。 因 此 ， 此 法 不作为 长 期 保 存 之

32、用。 6.2 冷冻真空干燥保存 法 在 各种 保 存 菌 种 的 方法 中， 以 冷冻 干 燥 法最 为理 想 。 在 冷冻 状 态 下 干 燥 和 在 真空 状 态 下 封闭 保 存 ， 使 菌 种 失去 代 谢 所 必 需 的水 分 ， 构 成 保持 细菌 长 久 不 变 的 良 好 条件， 可 避免 保 存 过程中 影响 菌 种 的 性 状 和 因 操作 造 成的 污 染 和 变 异 。 此 法可 长 期 保 存 菌 种 。 6.3 水生 真菌 类的 保存 6.3.1 水 霉 从感染 水 霉 的病鱼病 灶上 取 下水 霉 的 部分 菌 丝 ，用 5%的 福尔马林 保 存 。 6.3.2

33、鳃 霉 用 盖 片 涂抹 法 涂 片 ，用 5%福尔马林 保 存 患 鳃 霉 病的 部分 鳃组织 。 6.4 原生 动 物的 保存 6.4.1 涂 片 法 盖 片 涂抹 法 : 适用于所有的 微 小 寄 生 虫 。 干 涂 片 和 湿 涂 法 ：适用于 体 液 中 或 血 液 中的 原生 动 物 。 血 液 涂 片 法 ：用 微 吸 管 吸 取 一 小滴 血 液 ， 置 于 约 占 载 玻片 长 度 3/4的位 置上 ， 右 手 握 着同样 大 小 的 另 一 块 载 玻片 ， 一 端 与 放 有 血 滴 的 载 玻片上 的 血 滴前 面 接 触 ，而 与 平 置 桌 面 上 的 载 血 玻

34、片 约 成 40度 角倾斜 ， 然 后 将 血 滴 向 前 轻轻 地 推 移 。 干 片 制 备 法 ：不通过 固 定 液固 定， 让 材 料 在 空 气 中 干 燥 后， 再 进行 染 色 。 采 用 硝 酸 银法 染 色 后， 可 观察 斜 管 虫 的 腹 部 纤 毛线 ， 小 瓜 虫 、 肠袋 虫等 的 纤 毛线 ， 车轮 虫 的 齿 环 等 结构 。 6.4.2 70% 酒精或 4%福尔马林 浸泡 法 用 浓 度 为 70%酒精 或 浓 度 为 4%福尔马林 浸 泡 固 定鱼 体 病 变器官 或 组织 。 6.5 蠕 虫类 蠕虫 类包 括 单殖 吸 虫 、 复 殖 吸 虫 、 绦 虫

35、、 线 虫 、 棘头 虫 、 环 节 动 物 等 类 群 。 6.5.1 单 殖 吸 虫 用 2根 解剖 针 (最 好 竹 针 )， 在 解剖镜 下 将粘 附 在鳃片上 的 虫 体 挑 出， 再 用 吸 管 吸 取 ， 置 于 盛 有 清 水 的 玻皿里 ，用 甘 油 、 4%福尔马林 或 聚乙烯醇 把 虫 体 封 固 。 6.5.2 复 殖 吸 虫 复 殖 吸 虫 的成 虫 ， 大 多 数 寄 生 在 鱼 体 的 消 化 道 内 。 收集 标本 时 ， 将 鱼的 消 化 道 剪 开 ，用 解剖 刀 轻轻 刮 下 肠壁 的 内 含 物及 肠粘液 ， 放 入 培 养 皿 ， 加 入 生 理 盐

36、水 进行 搅拌 后，用 吸 管 吸 去混浊 的水， 再 重 新 加 入 新 水， 连续 更换 数次 ， 直 至 澄 清 ， 然 后 在 解剖镜 下检 查 ， 逐 一 把 虫 体 吸 出。 标本 固 定 前 ， 应 把粘 附 在 虫 体 上 的 粘液 和 组织 碎 片 冲洗 干 净 。用 吸 管 冲洗 时 ，防 止 吸 管 把 寄 生 虫带 到 另 一 个 培 养 皿 中 去 。 复 殖 吸 虫 的 固 定， 应 使 虫 体 尽 量 伸 展 而 又 不 致 虫 体 破裂 。 6.5.3 绦 虫 首先 把 虫 体 从组织 或 器官 中 取 出。 固 定 前 ， 应 把 虫 体 置 于水 里 ， 待

37、 虫 体 充 分 伸 展 时 ， 再 把 虫 体 压在 两 块 玻片 之 间 ， 保 存 在 70%的 酒精 里 。 6.5.4 线 虫 将 收集 到 的 线 虫 标本 放 在 盛 有 生 理 盐 水的 玻璃 试 管中适 当 地 摇 动 ， 将 虫 体 上 的 污 物 洗 净 后 再 行 固 定。 6.5.5 棘头 虫 棘头 虫 的 固 定和 保 存 方法 与 复 殖 吸 虫 相 似 。 应 使 吻 部 伸 出后 进行 固 定。 DB11/T 376 2006 7 6.6 软 体 动 物 (钩介 幼 虫 )和 甲壳动 物类 6.6.1 钩介 幼 虫 宜 用 70%酒精 固 定 保 存 。 6.

38、6.2 甲壳动 物 寄 生 在 鱼的 体 表 ， 虫 体 较 大 。 可 用 70%酒精 或 3% 4%的 福尔马林 溶 液固 定， 保 存 在 70%酒精 中。 组织 切 片 标本 则 用 葡翁 氏 液固 定。 葡翁 氏 液 配方 见 附 录 B。 6.6.3 藻 类 等 水生 植 物 水 生 植 物 中的 藻 类， 如 青 泥 苔 、水 网 藻 等 ， 可放 入 盛 有 4%福尔马林 的标本 瓶 里固 定 保 存 。 采 集 到 的水 生 植 物 和水草标本， 可 以 选择 较完 整 (有 花 、 果 实 和 枝叶 )的 植 株 ，用草 纸 或 适 当 的 吸 水 纸 压 制 成 干 标本

39、 保 存 。 植 物体 尽 可 能 按 照 它 的 生 活 状 态 ， 摆 在压 制 纸 上 ， 上 面 再 盖 上压 制 纸 ， 夹 在压 制 板 内 。 6.6.4 水生 昆 虫及 较 大 的水生 敌 害 动 物 等 用 10%福尔马林 固 定和 保 存 。 7 病原体的 鉴 定 7.1 病毒 7.1.1 用 光 学 显微 镜检查 鉴 定 制 成 涂 片 、 压片 、 或 石蜡切 片 等 进行 检 查 。包 括 用 吉姆萨 （ Giemsa） 染 色 法 等 染 色 检 查 。 7.1.2 电 子显微 镜法检查 鉴 定 染 色 方法 与 细胞学 的 染 色 方法 相 同 。 染 色 后 采

40、 用 电 子 显微镜 检 查 ，用 微观 照 相 或 摄 像 对 检 查 过程 进 行 拍 照 。 7.1.3 利 用 血 清学 诊断鉴 定 采 用中和 试 验 对 鱼类病 毒 传 染 病 进行 血 清学 诊 断 。 在 培 养的 组织 细胞 或 鱼 体 中， 将 毒 悬 液 与 抗血 清 按 比 例 混 合 中和， 然 后 将 病 毒 、 血 清 混 合 接 种 于 寄 主 系统 ， 测 定病 毒 的 感染 力 和 抗血 清 的 效 价 。 7.1.4 利 用 聚合酶链反应（ PCR） 技术 诊断鉴 定 PCR技术 具 有 高 度 敏 感 性 和 特 异 性 ， 能将 微 量 的 特 定 D

41、NA片段在 数 小 时 内 特 异 地 快速 扩增 至 数 百 万 倍 ， 快速 省 时 ， 广泛 应 用于 DNA和 RNA检 测 ， 在 病 毒 感染 的 诊 断 中， PCR技术 可 检 测 出 正 在 增 殖和 潜伏 的 病 毒 ， 也 可 诊 断 不 能 或 难 于 在 体 外培 养的病 毒 。 具 体 操作 按 照 仪器 用 法指 导 进行 。 7.1.5 利 用 酶联免 疫 吸 附 测定法 （ ELISA）诊断鉴 定 ELISA方法 是 在 酶 的 催 化 作用下 使原来 的 底物发生 水 解 、 氧 化或 其 它 反应 ， 生 成有 色 产 物 ， 可进行 定 性 或 半 定

42、量分 析 。 或 用 分 光光 度计进行进一 步 分 析 。 7.1.6 琼 脂 扩散 试验 7.1.6.1 双相琼 脂 扩散 法 置 室 温 下作用 24h， 观察 结 果 。 如 抗 原 抗 体 两 孔 出 现 清 晰 的 白 色 沉 淀 线 ， 则 为 阳 性反应 ， 无 沉 淀 线 为 阴 性反应 。 7.1.6.2 单 相琼 脂 扩散 法 配 成 3%琼 脂 ， 再 与 等 量 的 抗血 清 混 合 ， 即 成 1.5%琼 脂 。 然 后 打孔 ， 孔 距 5到 10mm， 向 孔 内 加 入 较 浓 的 抗 原 液 ， 也 可 做 不 同 稀释 度 ， 抗 原量使 之与 琼 脂 板

43、 相 平 即 可 。 然 后 平 置 室 温 5min-15min， 观察 结 果 。 孔周围 出 现 乳 白 色 沉 淀 环 的为 阳 性 。 7.1.7 荧光抗 体技术 预先 制 备 好 荧 光 抗 体 ， 可 以 在 24h内 获 得 诊 断 结 果 ， 具 体 准 备 工 作和操作 方法 按 照 有 关 指 导 进行 。 荧 光 抗 体 活 性测 定 方法 按 一 般 血 清学 方法 ， 如 抗 球 蛋 白 荧 光 抗 体可 用 环状 沉 淀 试 验 测 其 效 价 ； 抗 病 毒 荧 光 抗 体可 用 补 体 结 合 试 验 测 其 效 价 ； 抗 细菌 荧 光 抗 体可 用 凝 集

44、 试 验 测 其 效 价 。 7.2 细菌 DB11/T 376 2006 8 在 显微镜 下 观察细菌 的 大 小 、 形状 、 细胞 排 列、有 无 荚 膜 和 芽 孢 、有 无 鞭毛 、 鞭毛 的 数 目 及排 列、 革兰 氏 染 色反应 、 培 养和 菌 落 的 特征 等 ， 初步 鉴 定 细菌 的类 型 。 根据 细菌 的 具 体 类 型 ， 按 照 细菌 检 测 的 指 导 方法 ， 进一 步 鉴 定其 具 体种 类。 7.3 水生 真菌 类 通过 光学显微镜观察 其 活 体 的 形 态 结构 或 经 福尔马林 (或 酒精 )等溶 液 浸 泡保 存 的标本， 可 鉴 定其 种 类。

45、 根据 动 孢 子 囊 的产 生方 式 、 形状 、位 置 ， 以 及 产 生 的 动 孢 子数量 、 形状 、 鞭毛 着 生 和 发 育 情况 等 ， 可 以 区 分 出 各 个 属 。 7.4 藻 类及寄生虫 除观察 其 活 体 标本 外 ，其 余 应 采 用 固 定 剂 固 定和 染 色 后， 在 显微镜 下 观察 其 形 态 结构 ， 确 定其 属 、 种 。 8 病原体标 本材料 的 记录 、标 签 和整理 制好 的标本， 都 应 有 详 细 的 记 录 和标 签 。标 签 上 应 注 明 编 号 、 当 地 名称 、 采 集 时间 、 采 集 地 点 、病 原体 在 当 地的 危

46、害 情况 、 寄 主 生物 的 情况 、病 原体 的 流 行情况 等 。 8.1 材料 的 记录 和标 签 8.1.1 材料 的 记录 用 碳 素 墨 水 笔 或 黑 签 字 笔书写 。 如果 有 现 成 资 料 ， 应 收集 整 理 好 ， 编 好号 码 ， 必 要 时 把 所了 解 的 部分 材 料 摘 录 下 来 。 收集 到 的鱼类 标本和病 原体 材 料 ，要 避免 在 冲洗 、 移 动 、 固 定 时 发生 混 乱 和 错 误 。 如果 标本 无 标 签 或 不 清 楚 ， 则 不 能 采 用。 8.1.2 标 签 8.1.2.1 临 时 性的标 签 在 进行 检 查 时取 出的

47、各 个 器官 或 病 原 ，为 避免 混 乱 而 临 时 标 上 的标 签 。 临 时性 使 用 至 标本 装 入 标本 瓶 换 上 永 久 性 标 签 时 为 止 。 8.1.2.2 永久 性的标 签 用于 已 经 固 定 好 的标本 或 经 过 固 定、 染 色 的病 原体 标本。 应清 楚 地标 明 病 原体 的类 别 、病 变 的 器官 部 位、 固 定 保 存 的 方法 、标本的 名称 和 编 号 、检 查 日期和地 点 ， 必 要 时 写 上 收集 者 的 姓 名 。 鱼类标本的 编 号 要 同 记 录 本 或 记 录 卡 上 的 编 号 一 致 ， 以 便 查 对 。 载 玻片

48、涂 片 或 封 存 的 寄 生 虫 标本， 则 用 大 小 式 样 相 同 的标 签 ， 写 上 名称 、 寄 主和 寄 生 的 部 位、 发 现 寄 生 虫 地 点 、日期， 固 定和 染 色 方法 以 及 制 片 的日期 等 。 8.1.2.3 记录 明 细 卡 具 体 见 表 1。 DB11/T 376 2006 9 表 1 记录 明 细 卡 水 体 编 号 ： 日期： 鱼 名 ： 编 号 ： 鱼 体 重 ： 病 原体 学名 病 原体 俗 名 标本 编 号 寄 生 部 位 数量 症 状及 标 本 处 理 采 集 寄 生 虫 地 点 固 定和 染 色 方法 备 注 8.2 标 本 的 包装

49、 和整理 8.2.1 细菌 等 病原体标 本 将 收集 到 的 器官 组织 ， 放 入 盛 有 冰块 的 瓶 内 ， 迅 速 地 送 往实 验 室 编 号 安 置 。 8.2.2 原生 动 物标 本 把 准 备 好 的 平 底 玻 管， 装 入 适 量 的 70%酒精 （ 酒精 的 高 度 应 超 过 固 定标本的 盖 片 的 高 度） 。 酒精 的 表 面 和 瓶 塞 之 间 的 空 隙 用 脱 脂 棉 填 塞 。 保 存 标本用的 平 底 玻 管用 脱 脂 棉塞紧 瓶 口。 应 注 意勿 使 脱 脂 棉 与 酒精 之 间 留 有 空 隙 ， 然 后 将 平 底 玻 管 逐 个 放 入 另 一 个 大 的 盛 有 保 存 液 （ 70%酒精 ） 的 广 口 瓶 里 。 广 口 瓶 内 外应 有 总 标 签 ，标 明 标本的类 群 ， 固 定 液 的 种 类 等 。 9 淡 水鱼类检疫 基 本操作 按 GB/T 15805.1的规定 执 行 。 10 常见淡 水鱼类 疾 病的 预 防 操作 按 DB11/T 196有 关 养殖水 质调 控 、鱼病 预 防的规定 执 行 。