DB15 T 4230-2025 牛、羊产气荚膜梭菌病荧光定量PCR诊断技术.pdf

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1、 ICS 65.020.01 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 42302025 牛羊产气荚膜梭菌病荧光定量 PCR 诊断技术 Fluorescent quantitative PCR diagnostic techniques for Clostridium perfringens infections in cattle and sheep 2025-10-30 发布2025-11-30 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 42302025 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。

2、请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、准格尔旗动物疫病预防控制中心、内蒙古兴安盟突泉县动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区质量和标准化研究院。本文件主要起草人：韩四娥、徐丽媛、金鹰、史文瑞、张博、乔煜婷、关平原、李劼、赵丽霞、徐晓静、郭宇、刘慧、周治国、王震、刘月。DB15/T 42302025 1 牛、羊产气荚膜梭菌病荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本文件规定了

3、牛、羊产气荚膜梭菌病的临床诊断、样品采集和保存、荧光定量PCR定种和分型鉴定方法。本文件适用于牛、羊产气荚膜梭菌病的诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 3073 家畜魏氏梭菌病诊断技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。牛产气荚膜梭菌病 clostridium perfringens infections

4、 in cattle 由产气荚膜梭菌引起牛的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快，多以出血性坏死性肠炎和全身毒血症为主要特征。羊产气荚膜梭菌病 clostridium perfringens infections in sheep由产气荚膜梭菌引起羊的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快。死后解剖可见特征性的出血性肠炎、“肾软化”等病变。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CP：产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）P

5、BS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）DB15/T 42302025 2 qPCR：荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）5 临床诊断 按照 NY/T 3073 相关规定执行。6 样品采集和保存 按照 GB 19489 和 NY/T 541 相关规定执行。7 荧光定量 PCR 定种鉴定 仪器设备 7.1.1 二级生物安全柜。7.1.2 台式低温高速离心机。7.1.3 组织研磨仪或研钵。7.1.4 全自动核酸提取仪。7.1.5 荧光

6、定量 PCR 仪。7.1.6 旋涡混匀器。7.1.7 微量可调移液器（1 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1 000 L）。试剂材料 7.2.1 无酶无菌带滤芯吸头。7.2.2 PCR 扩增管。7.2.3 商品化 PCR 预混液。7.2.4 商品化细菌 DNA 提取试剂盒。7.2.5 阴性对照：DEPC 水。7.2.6 阳性对照：带目的片段的质粒 DNA，制备方法与基因序列见附录 A 中的 A.1、A.2。7.2.7 引物和探针见附录 A 中 A.3，加 DEPC 水配制成 100 mol/L 的储存浓度和 10 mol/L 工作浓度。试验方法 7.3.1 样品处

7、理 7.3.1.1 肛拭子样品在1 mL PBS中反复挤压肛拭子样品，使用旋涡混匀器充分涡旋振荡后，备用。7.3.1.2 粪便、肠道内容物及其他组织样品无菌取粪便或肠道内容物约1 g，加入5 mL PBS，混合均匀，备用；或剪取典型病变组织约1 g，加入5 mL PBS，于组织研磨仪或研钵中充分研磨成悬液，备用。7.3.2 样品 DNA 提取 DB15/T 42302025 3 采用细菌DNA提取试剂盒或用全自动核酸提取仪，提取各类样品（肛拭子、粪便、肠道内容物及其他组织样品等）中的细菌DNA。7.3.3 反应体系配制产气荚膜梭菌qPCR定种鉴定反应总体系为25 L，使用附录A中A.3的产气荚

8、膜梭菌定种引物及探针，按照表1配制qPCR定种鉴定反应体系，瞬时离心后，放入荧光定量PCR仪中进行反应，同时设阴性对照和阳性对照。表1 qPCR 定种鉴定反应体系 组分 体积/L 2Hieff Unicon Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5 CP-上游引物（10 mol/L）0.75 CP-下游引物（10 mol/L）0.75 CP-荧光探针（10 mol/L）0.5 模板DNA 5 加DEPC水至 25 7.3.4 反应程序95 预变性5 min；95 变性15 s，60 退火/延伸30 s（收集荧光），共45个循环。结果判定 7

9、4.1 试验成立条件 阴性对照无 Ct 值或 Ct 值40 且未出现特异性扩增曲线，阳性对照 Ct 值35 且出现特异性扩增曲线，判为试验成立。否则，本次试验无效。7.4.2 判定标准 被检样品 Ct 值35 且出现特异性扩增曲线，判定为 CP 核酸阳性；被检样品无 Ct 值或 Ct 值40，判定为 CP 核酸阴性；被检样品 35Ct 值40 且出现特异性扩增曲线，判定为 CP 核酸可疑，需复检。如复检结果为阳性或可疑，则判定为 CP 核酸阳性，否则判定为阴性。8 多重荧光定量 PCR 分型鉴定 仪器设备 见 7.1。试剂材料 8.2.1 无酶无菌带滤芯吸头。8.2.2 PCR 扩增管。8.

10、2.3 商品化 PCR 预混液。8.2.4 商品化细菌 DNA 提取试剂盒。8.2.5 阴性对照：DEPC 水。8.2.6 阳性对照：AG 型 CP 阳性对照分别为带目的片段的重组质粒，制备方法与基因序列见附录 BDB15/T 42302025 4 中的 B.1、B.2。8.2.7 引物和探针见 B.3，加 DEPC 水配制成 100 mol/L 的储存浓度和 10 mol/L 工作浓度。试验方法 8.3.1 样品处理 肛拭子样品与粪便、肠道内容物及其他组织样品处理分别按照 7.3.1.1 与 7.3.1.2。8.3.2 样品 DNA 提取 按照 7.3.2 方法。8.3.3 反应体系配制 使

11、用附录 B 中 B.3 的毒素基因分型引物及探针，按照表 2（含、毒素引物与探针）和表 3（含、cpe、NetB 毒素引物与探针）分别配制多重荧光定量分型鉴定反应体系 1 与反应体系 2。瞬时离心后，放入荧光定量 PCR 仪中进行反应，同时设阴性对照和阳性对照（分别加、毒素的阳性对照与加、cpe、NetB 毒素的阳性对照）。表2 多重荧光定量分型鉴定反应体系 1 组分 体积/L 2Hieff Unicon Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5 毒素-F（10 mol/L）1.0 毒素-R（10 mol/L）1.0 毒素-P（10 mol

12、/L）0.5 毒素-F（10 mol/L）1.0 毒素-R（10 mol/L）1.0 毒素-P（10 mol/L）0.5 毒素-F（10 mol/L）1.0 毒素-R（10 mol/L）1.0 毒素-P（10 mol/L）0.5 模板 DNA 5 总体积 25 DB15/T 42302025 5 表3 多重荧光定量分型鉴定反应体系 2 组分 体积/L 2Hieff Unicon Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5 毒素-F（10 mol/L）1.0 毒素-R（10 mol/L）1.0 毒素-P（10 mol/L）0.5 cpe 毒素-

13、F（10 mol/L）1.0 cpe 毒素-R（10 mol/L）1.0 cpe 毒素-P（10 mol/L）0.5 NetB 毒素-F（10 mol/L）1.0 NetB 毒素-R（10 mol/L）1.0 NetB 毒素-P（10 mol/L）0.5 模板 DNA 5 总体积 25 8.3.4 反应程序95 预变性5 min；95 变性15 s，60 退火/延伸30 s（收集荧光），共45个循环。结果判定 8.4.1 试验成立条件 按照 7.4.1 分别判定每个通道阴性、阳性对照是否成立。8.4.2 判定标准 8.4.2.1 若被检样品在对应不同通道 Ct 值35 且出现特异性扩增曲线，则

14、判定为对应的 A 型、B 型、C 型、D 型、E 型、F 型或 G 型 CP 核酸阳性。8.4.2.2 若被检样品在对应通道 35Ct 值40 且出现特异性扩增曲线，判定为可疑，需复检。如复检结果为阳性，则判定为 CP 相应血清型核酸阳性，否则判定为阴性。8.4.2.3 若被检样品在对应通道无 Ct 值或 Ct 值40，判定为 CP 相应血清型核酸阴性。具体血清型判定标准见表 4。DB15/T 42302025 6 表4 AG 型产气荚膜梭菌核酸阳性判定标准 血清型 反应体系 1 反应体系 2 毒素 毒素 毒素 毒素 cpe 毒素 NetB 毒素 FAM HEX CY5 FAM ROX CY5

15、 A 型+-B 型+-C 型+-+/-D 型+-+-+/-E 型+-+/-F 型+-+-G 型+-+注：“+”表示Ct值35且出现特异性扩增曲线；“-”表示无Ct值或Ct值40，或35Ct值40且出现特异性扩增曲线，经复检未达“+”标准；“+/-”表示出现“+”或“-”。9 综合判定 疑似病例 符合NY/T 3073临床诊断中描述的相应临床症状和病理变化，判定为牛或羊产气荚膜梭菌病疑似病例。确诊病例 疑似病例经产气荚膜梭菌荧光定量 PCR 定种鉴定或多重荧光定量 PCR 分型鉴定阳性者判定为产气荚膜梭菌病确诊病例。DB15/T 42302025 7 A A附录A （资料性）荧光定量 PCR 定

16、种鉴定阳性对照及引物和探针序列 A.1 荧光定量 PCR 检测阳性对照的制备 将产气荚膜梭菌毒素基因169 bp目的片段连接pCR4-TOPO载体，再转化到JM109感受态细胞中，制备成重组大肠杆菌菌株，克隆培养后提取重组质粒。取适量质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“copies/L=（6.021023 copies/mol浓度ng/L）/（DNA碱基数6.601011 ng/mol）”计算质粒的拷贝数（copies），用TE缓冲液连续梯度稀释至1104 copies/L，作为阳性对照，检验后定量分装，-15 以下保存。A.2 荧光定量 PCR 扩增特异性片段基因序列 参考产气荚膜梭

17、菌 ATCC 13124 菌株（NCBI Reference Sequence:NC_008261.1）毒素基因序列，设计荧光定量 PCR 引物探针，可扩增 169 bp 的目的片段，基因序列如下：tacattctatcttggagaggctatgcactattttggagatatagatactccatatcatcctgctaatgttactgccgttgatagcgcaggacatgttaagtttgagacttttgcagaggaaagaaaagaacagtataaaataaacacagcaggttgcaaaactaatgag A.3 荧光定量 PCR 引物和探针 A.3.1 CP上游引物

18、5-TAC ATT CTA TCT TGG AGA GGC T-3。A.3.2 CP下游引物：5-CTC ATT AGT TTT GCA ACC TGC T-3。A.3.3 CP荧光探针：5-（FAM）CCT GCT AAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GC（BHQ1）-3。DB15/T 42302025 8 B B附录B （资料性）多重荧光定量 PCR 分型鉴定阳性对照及引物和探针序列 B.1 多重荧光定量 PCR 检测阳性对照的制备 将产气荚膜梭菌毒素基因169 bp目的片段、毒素基因的131 bp目的片段、毒素基因的128 bp目的片段分别连接pCR4-TOPO载体

19、再转化到JM109感受态细胞中，制备成3株重组大肠杆菌菌株，克隆培养后提取重组质粒。取适量的以上3种质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“copies/L=（6.021023 copies/mol浓度ng/L）/（DNA碱基数6.601011 ng/mol）”计算质粒的拷贝数（copies），使用TE缓冲液均稀释至11010copies/L，再将稀释的3种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:1:7的比例混合均匀后，标记为1109copies/L阳性质粒混合液，将混合液连续梯度稀释至1104 copies/L，作为反应体系1阳性对照，检验后定量分装，-15 以下保存。选取包含产气荚膜梭菌毒素基

20、因的qPCR引物目的基因片段附近480个碱基进行基因合成，将合成的基因片段连接pUC57载体，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构建带产气荚膜梭菌毒素基因的重组大肠杆菌，克隆培养后提取重组质粒；选取包含产气荚膜梭菌cpe毒素基因的qPCR引物目的基因片段附近501个碱基进行基因合成，将合成的基因片段连接pUC57载体，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构建带产气荚膜梭菌cpe毒素基因的重组大肠杆菌，克隆培养后提取重组质粒；选取包含产气荚膜梭菌NetB毒素基因qPCR引物目的基因片段附近983个碱基进行基因合成，将合成的基因片段连接pUC57载体，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构

21、建带产气荚膜梭菌NetB毒素基因的重组大肠杆菌，克隆培养后提取重组质粒。取适量的以上3种质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“copies/L=（6.021023 copies/mol浓度ng/L）/（DNA碱基数6.601011 ng/mol）”计算质粒的拷贝数（copies），使用TE缓冲液均稀释至11010copies/L，再将稀释的3种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:1:7的比例混合均匀后，标记为1109copies/L阳性质粒混合液，将混合液连续梯度稀释至1104 copies/L，作为反应体系2阳性对照，检验后定量分装，-15 以下保存。B.2 多重荧光定量 PCR 扩增特异性

22、片段基因序列 B.2.1 毒素阳性对照基因序列 参考产气荚膜梭菌 ATCC 13124 菌株（NCBI Reference Sequence:NC_008261.1）毒素基因序列，设计荧光定量 PCR 引物探针，可扩增 169 bp 的目的片段，基因序列如下：TACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAG

23、B.2.2 毒素阳性对照基因序列 参考产气荚膜梭菌 ATCC 3626 菌株（NCBI Reference Sequence:NZ_CP116438.1）毒素基因序列，设计荧光定量 PCR 引物探针，可扩增 131 bp 的目的片段，基因序列如下：AGCTGTTACTTTGTGAGTAAGCCAATTTATTTTGAATGTAAATATATGACTATCTACATTTGGGGTATCAAAAGCTAGCCTGGAATAGACTTGTCCTACCCAGTTAGCACCATTCCAATTAAGATAATAAC B.2.3 毒素阳性对照基因序列 参考产气荚膜梭菌 ATCC 3626 菌株（NCBI

24、Reference Sequence:NZ_CP116438.1）毒素基因序列，设计荧光定量 PCR 引物探针，可扩增 128 bp 的目的片段，基因序列如下：DB15/T 42302025 9 CCAGCTAATACTACTGTAGAAGTAATAGCATATTTAAAAAAAGTTAATGTTAAAGGAAATGTAAAGTTAGTAGGACAAGTAAGTGGAAGTGAATGGGGAGAGATACCTAGTTATTTAGCTTTTCCTAG B.2.4 合成毒素阳性对照基因序列 TTATGGGGAAAAGAAAATTATAGTGATTGGAGTAATAAATTAACTCCTAATGAA

25、CTTGCTGATGTAAATGACTATATGCGTGGAGGATATACCGCAATTAATAACTATTTAATATCAAATGGTCCTTTAAATAATCCTAATCCAGAACTAGACTCTAAAGTAAATAACATTGAAAACGCATTAAAGCTCACACCTATTCCATCTAACTTAATTGTATATAGAAGGTCTGGTCCACAAGAATTTGGATTAACTCTCACATCTCCTGAATATGATTTTAATAAAATAGAAAATATAGATGCTTTTAAAGAAAAATGGGAAGGAAAAGTAATAACATACCCAAACTTTATTAGTACT

26、AGTATTGGAAGTGTAAATATGAGTGCATTTGCTAAAAGAAAAATAATACTACGTATAAACATACCAAAAGATTCTCCAGGAGCTTATTTATCAGCCATTCCAGGTTATGCAGGAGAATATGAAGTAB.2.5 合成cpe毒素阳性对照基因序列 AGCTATCTGCAGATGTTTTACTAAGCCATATTCCTGTTAATTTATAAATTGATCCATCATCAGAGATATTACCATGAGAAATTCTAATAGCTTGATACTTTCTATAAGTTGCATAAACCTTATAATATACATATTCATTTGGACCAGCAGTT

27、GTAGATACAGATCTTTCTATTGTATTTTGTTCTCCTATAGTTATTCCAAATCCATATTCTACAGATGCTTGTATAAATTCAGAAGTAAATCCAACTGAAAAATTTACATTTATAGATACTTCTTTAGATTTAGTTAATGATTGGCTAAAGGTACCTGTTTCATTAGGATTAAGAATTTGACTTGAAACTACTGAGGGTTCCCCTAATATCCAACCATCTCCTTTATCTATTACATATAATCCATCACTTAAATTTGAGTTAGAGTTTGTAATATTAATTGGTGTTTTTAAATCCTCAGAA

28、ATAAGAAATACTTCTTTAGCATTTTCGAACACCATTGGATTTAAATTGT B.2.6 合成NetB毒素阳性对照基因序列 AAGGAGGAATTATTTTGAAAAGATTAAAAATTATTTCAATTACACTAGTTCTTACAAGTGTAATTAGTACAAGCCTTTTTTCAACTCAAACTCAAGTTTTTGCAAGTGAATTAAATGACATAAACAAAATTGAGTTGAAAAATCTAAGTGGAGAAATAATAAAAGAAAATGGAAAGGAAGCTATTAAATATACTTCTAGTGATACCGCTTCACATAAAGGTTGGAAG

29、GCAACTTTAAGTGGAACATTTATTGAAGATCCTCATTCTGATAAGAAAACTGCTTTATTAAATTTAGAAGGATTTATACCTTCTGATAAACAGATTTTTGGTTCTAAATATTACGGAAAAATGAAATGGCCTGAAACTTATAGAATTAATGTAAAAAGTGCTGATGTAAATAATAATATAAAAATAGCAAATTCTATTCCTAAAAATACTATAGATAAAAAAGATGTATCTAATTCAATTGGTTATTCTATAGGCGGTAATATATCTGTTGAAGGAAAAACTGCTGGTGCTGGAATAAAT

30、GCTTCATATAATGTCCAAAATACTATAAGCTATGAACAACCTGATTTTAGAACAATTCAAAGAAAAGATGATGCAAATTTAGCATCATGGGATATAAAATTTGTTGAGACTAAGGACGGTTATAATATAGATTCTTATCATGCTATTTATGGAAATCAATTATTCATGAAATCAAGATTGTATAATAATGGTGATAAAAATTTCACAGATGATAGAGATTTATCAACATTAATTTCTGGTGGATTTTCACCCAATATGGCTTTAGCATTAACAGCACCTAAAAATGCTAAAGAATCTGTA

31、ATAATAGTTGAATATCAAAGATTTGATAATGACTATATTTTAAATTGGGAAACTACTCAATGGCGAGGAACAAACAAACTTTCGTCAACAAGTGAATATAACGAATTTATGTTTAAAATAAATTGGCAAGATCATAAAATAGAATATTATCTGTAAB.2.4B.2.6加粗位置为荧光定量PCR扩增片段基因。B.3 多重荧光定量 PCR 引物和探针 多重荧光定量 PCR 引物和探针序列见表 B.1。DB15/T 42302025 10 表B.1 多重荧光定量 PCR 分型鉴定引物/探针 引物/探针名称 引物/探针序列（5-3）毒素-F

32、 TACATTCTATCTTGGAGAGGCT 毒素-R CTCATTAGTTTTGCAACCTGCT 毒素-P（FAM）CCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGC（BHQ1）毒素-F GTTATTATCTTAATTGGAATGGTGC 毒素-R AGCTGTTACTTTGTGAGTAAGC 毒素-P（HEX）TGGGTAGGACAAGTCTATTCCAGGCT（BHQ1）毒素-F CCAGCTAATACTACTGTAGAAGT 毒素-R CTAGGAAAAGCTAAATAACTAGGT 毒素-P（CY5）AGGACAAGTAAGTGGAAGTGAATGGGGAG（BHQ2）毒

33、素-F CGTGGAGGATATACYGCAAT 毒素-R TCATATTCAGGAGATGTGAGAGT 毒素-P（FAM）TCCAAATTCTTGWGGACCAGACCT（BHQ1）cpe 毒素-F TACTAAGCCATATTCCTGTT cpe 毒素-R ACAACTGCTGGTCCAAATGA cpe 毒素-P（ROX）TCCATCATCAGAGATATTACCATGAGA（BHQ2）NetB 毒素-F GGCTTTAGCATTAACAGCACCT NetB 毒素-R TCACTTGTTGACGAAAGTTTGTT NetB 毒素-P（CY5）TGTTCCTCGCCATTGAGTAGTTTCCCA（BHQ2）