DB12 T 1190-2023 牛乳中A2型β-酪蛋白(A2奶)检测技术规程.pdf
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1、ICS65.020.30CCS B 4512天津市地方标准DB12/T 11902023牛乳中 A2 型-酪蛋白(A2 奶)鉴别技术规程Code of practice for identification of A2 type of-casein(A2 milk)in cows milk2023-04-07 发布2023-05-07 实施天津市市场监督管理委员会发 布DB12/T 11902023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位:天津市农业科学院。本文件主要起草人:马毅
2、、谭冬飞、陈丽丽、赵康、张漫、芦娜、王丽学。DB12/T 119020231牛乳中 A2 型-酪蛋白(A2 奶)鉴别技术规程1范围本文件规定了的牛奶中A2型-酪蛋白(A2奶)的检测原理、主要试剂配制、主要仪器设备、质谱检测及数据处理参数、检测方法、结果判定、废弃物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施。本文件适用于牛奶和奶粉中A2型-酪蛋白(A2奶)的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验
3、方法GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1A2 型-酪蛋白A2-casein;A2 CSN2-酪蛋白由209个氨基酸组成,其一级序列中的第67位氨基酸的种类为脯氨酸(Proline,P)时,称为A2型-酪蛋白。3.2A2 奶A2 milk所含-酪蛋白为A2型的牛奶。3.3质荷比mass-to-charge ratio离子的质量m与其所带的电荷数z之比,以m/z表示。4检测原理-酪蛋白变体型对应的氨基酸突变位点为第67位组氨酸(Histidine,H)突变为脯氨酸(Proline,P),不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术,根
4、据差异肽段的分子量及质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来,从而确定氨基酸突变位点,实现对不同突变体型-酪蛋白检测的目的。5试剂配制实验所用水为符合GB/T 6682规定的一级水;高压灭菌条件为121,1.034*105Pa压力,蒸汽灭菌20min。试剂配制如下:DB12/T 119020232样品裂解液:将 480.4 g 尿素,7.1 g HEPES 溶于 800 mL 蒸馏水中,充分溶解后,定容至 1 L;10%SDS(十二烷基硫酸钠):将 10 g SDS 粉末溶于 80 mL 蒸馏水中,加热至 68助溶,用HCl 调 pH 至 7.2,定容至 1000 mL,0.2 m
5、 的滤膜过滤,高压灭菌;30%丙烯酰胺:将 29 g 丙烯酰胺和 1 g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60 mL 的蒸馏水中,充分溶解后,定容至 100 mL;1.5mol/L Tris-HCl(pH=8.8):将 181.65 g Tris 溶于 800 mL 水中,加浓盐酸调 pH 至 8.8,容至 1000 mL;1mol/L Tris-HCl(pH=6.8):将 121.1 g Tris 溶于 800 mL 水中,加浓盐酸调 pH 至 6.8,容至 1000 mL;10%过硫酸铵:将 10 g 过硫酸铵粉末溶于 80 mL 蒸馏水中,充分溶解后,定容至 100 mL;考马斯亮蓝
6、染色液:量取甲醇 45 mL,蒸馏水 45 mL,冰乙酸 10 mL,加入 0.25 g 考马斯亮蓝R-250;考染脱色液:50 mL 碳酸氢铵/乙腈=1:1;1g/L 胰蛋白酶:将 100 g 胰蛋白酶溶解到 100 L 50 mmol/L 乙酸中,-70储存;25mmol/L 碳酸氢铵:将 2.0 碳酸氢铵溶于 800 mL 蒸馏水中,充分溶解后,定容至 1 L。6仪器设备6.1单道可调移液器0.252.5l、110l、220l、550l、10100l、20200l、1001000l。6.210K 超滤管超滤管截留蛋白分子量:3090 KDa。6.3离心机最高转速12 000 r/min,
7、最大容量241.5 mL。6.4电子天平万分之一精度。6.5凝胶成像分析系统有胶像素12801024,检测灵敏度DNA0.05 ng。6.6稳压稳流电泳仪输出电压0600 V,输出电流0100 mA。6.7垂直电泳槽外形尺寸15 cm12 cm13 cm,凝胶板面积10 cm10 cm。6.8高压灭菌锅使用温度范围45135,最高使用压力0.255 Mpa。6.9自动双重纯水蒸馏器DB12/T 119020233功率3 000 W,出水量2 500 mL/h。6.10微波炉功率700 W,容积2 0L。6.11冰箱4,-20。6.12电热恒温水浴锅RT+570 7质谱检测及数据处理参数应按照附
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