1、ICS65.020.30CCS B 4512天津市地方标准DB12/T 11902023牛乳中 A2 型-酪蛋白（A2 奶）鉴别技术规程Code of practice for identification of A2 type of-casein(A2 milk)in cows milk2023-04-07 发布2023-05-07 实施天津市市场监督管理委员会发 布DB12/T 11902023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：天津市农业科学院。本文件主要起草人：马毅
2、、谭冬飞、陈丽丽、赵康、张漫、芦娜、王丽学。DB12/T 119020231牛乳中 A2 型-酪蛋白（A2 奶）鉴别技术规程1范围本文件规定了的牛奶中A2型-酪蛋白（A2奶）的检测原理、主要试剂配制、主要仪器设备、质谱检测及数据处理参数、检测方法、结果判定、废弃物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施。本文件适用于牛奶和奶粉中A2型-酪蛋白（A2奶）的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验
3、方法GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1A2 型-酪蛋白A2-casein；A2 CSN2-酪蛋白由209个氨基酸组成，其一级序列中的第67位氨基酸的种类为脯氨酸（Proline,P）时，称为A2型-酪蛋白。3.2A2 奶A2 milk所含-酪蛋白为A2型的牛奶。3.3质荷比mass-to-charge ratio离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。4检测原理-酪蛋白变体型对应的氨基酸突变位点为第67位组氨酸（Histidine,H）突变为脯氨酸（Proline,P），不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根
4、据差异肽段的分子量及质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同突变体型-酪蛋白检测的目的。5试剂配制实验所用水为符合GB/T 6682规定的一级水；高压灭菌条件为121，1.034*105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制如下：DB12/T 119020232样品裂解液：将 480.4 g 尿素，7.1 g HEPES 溶于 800 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 1 L；10%SDS（十二烷基硫酸钠）：将 10 g SDS 粉末溶于 80 mL 蒸馏水中，加热至 68助溶，用HCl 调 pH 至 7.2，定容至 1000 mL，0.2 m
5、 的滤膜过滤，高压灭菌；30%丙烯酰胺：将 29 g 丙烯酰胺和 1 g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60 mL 的蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL；1.5mol/L Tris-HCl（pH=8.8）：将 181.65 g Tris 溶于 800 mL 水中，加浓盐酸调 pH 至 8.8，容至 1000 mL；1mol/L Tris-HCl（pH=6.8）：将 121.1 g Tris 溶于 800 mL 水中，加浓盐酸调 pH 至 6.8，容至 1000 mL；10%过硫酸铵：将 10 g 过硫酸铵粉末溶于 80 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL；考马斯亮蓝
6、染色液：量取甲醇 45 mL，蒸馏水 45 mL，冰乙酸 10 mL，加入 0.25 g 考马斯亮蓝R-250；考染脱色液：50 mL 碳酸氢铵/乙腈=1：1；1g/L 胰蛋白酶：将 100 g 胰蛋白酶溶解到 100 L 50 mmol/L 乙酸中，-70储存；25mmol/L 碳酸氢铵：将 2.0 碳酸氢铵溶于 800 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 1 L。6仪器设备6.1单道可调移液器0.252.5l、110l、220l、550l、10100l、20200l、1001000l。6.210K 超滤管超滤管截留蛋白分子量：3090 KDa。6.3离心机最高转速12 000 r/min，
7、最大容量241.5 mL。6.4电子天平万分之一精度。6.5凝胶成像分析系统有胶像素12801024，检测灵敏度DNA0.05 ng。6.6稳压稳流电泳仪输出电压0600 V，输出电流0100 mA。6.7垂直电泳槽外形尺寸15 cm12 cm13 cm，凝胶板面积10 cm10 cm。6.8高压灭菌锅使用温度范围45135，最高使用压力0.255 Mpa。6.9自动双重纯水蒸馏器DB12/T 119020233功率3 000 W，出水量2 500 mL/h。6.10微波炉功率700 W，容积2 0L。6.11冰箱4，-20。6.12电热恒温水浴锅RT+570 7质谱检测及数据处理参数应按照附
8、录A执行。8检测方法8.1样本采集每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶和末乳）50 mL，充分混匀后，-80 保存。8.2蛋白提取8.2.1从-80 取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样 50 L。8.2.2向上述样品中加入 500 L 裂解液8 mol/L 尿素，30 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）。冰上裂解 10 min。4，20 000g，离心 30 min。取上清，避免吸到油脂。8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度 10 mmol/L。56 水浴 1 h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度 55 mmol/L，暗室静置 1 h。8.2.4使用考马斯蓝染色法（
9、Bradford 法）对蛋白质进行定量。8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析（如附录 C.1）。8.3蛋白质的消化8.3.1取 8.2.5 中蛋白 20 g，加入到 10 K 超滤管中，14 000 g，4，离心 40 min，弃废液。8.3.2加入 200 L 的 25 mmol/L 碳酸氢铵（NH4HCO3），14 000 g，4，离心 40 min，弃废液。8.3.3重复 8.3.2 步骤两遍。8.3.4加入 1 g/L 的胰蛋白酶（Trypsin）和 V8 蛋白酶（Glu-C）各 1 L，37 水浴 24 h。离心收集消化后的肽段。8
10、.3.5真空抽干消化后的肽段。8.3.60.1%甲酸（FA）复溶肽段。8.4质谱鉴定8.4.1将 8.3.5 提取的酪蛋白肽段进行上机检测。使用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪对获得的酪蛋白肽段进行分离并检测，液相及质谱检测参数见表 1表 3。DB12/T 119020234表 1液相色谱柱参数项目参数色谱柱Waters Xbridge BEH300 C18(100 mm2.1 mm 3.5 m)流动相 A0.2%甲酸-水(v/v)流动相 B0.2%甲酸乙腈(v/v)柱温箱40流速0.3 mL/min进样体积5L表 2液相色谱流动相洗脱梯度时间（分）B 液比例02%22%510%2040%
11、2295%2595%25.12%282%表 3质谱检测-离子源参数参数名称参数值离子模式正离子模式母离子扫描范围50-2000 m/z二级分辨率30000离子源温度500离子化电压5500 V采集模式数据依赖型采集(Independent data acquired,IDA)碰撞能量3515 V气帘气氮气 35 psi雾化气氮气 50psi辅助加热气氮气 50 psi8.4.2对原始数据进行过滤、峰提取和筛选，确定特征性肽段。质谱扫描完毕，得到质谱原始文件，将质谱原始数据文件导入后，进行一级色谱峰的滤噪、峰提取、筛选出含有 p.67 位氨基酸的特征肽段，DB12/T 119020235筛选参数
12、见表 4。表 4质谱峰筛选参数参数名称实验选项母离子质量范围50-2000 Da质量偏差宽度0.02 Da保留时间偏差0.2 min信噪比 S/N 域值38.4.3筛选后的差异性肽段用 Proteinpilot 软件进行差异肽段序列的比对和鉴定，检索参数见表 5。表 5鉴定检索参数参数名称参数条件烷基化试剂碘乙酰胺可变修饰Oxidation(M),GlnPyro-Glu(N-term Q)Phospho(ST),SerArg(S),SerLys(S),ArgCys(R),GlnGlu(Q),GluLys(E),MetLeu(M),ProHis(P),ProLeu(P),HisGln(H)质量偏
13、差0.35 Da最大允许漏切数1酶的类型(Enzyme)Trypsin置信度(FDR)95%数据库(Database)https:/www.uniprot.org/_Bos taurus9结果判定9.1SDS-PAGE 鉴定将从样品中提取的蛋白质进行SDS-PAGE分离鉴定，检测蛋白条带是否清晰无降解。条带清晰，表示可用于后续检测，否则重新取样鉴定，检测结果见图1。DB12/T 119020236图 1SDS-PAGE 检测结果（红框内条带为-酪蛋白）9.2A2 型-酪蛋白的判定根据质谱鉴定结果，当待测样品的中 p.67 H 氨基酸突变为 p.67 P（如图 2），检测结果表述为“A2奶”。注
14、：虚线框内为不同变体型-酪蛋白的突变位点。图 2A2 型-酪蛋白对应的氨基酸序列10废弃物处理应按照GB/T 19495.2的规定执行。11交叉污染防止措施应按照GB/T 19495.2的规定执行。DB12/T 119020237AA附录A（规范性）特征肽段质谱图筛选并鉴定到的特征性肽段为LVYPFPGPIPN(59位到68位)，肽段中N端碎片离子为b离子模式，C端碎片离子为y离子模式，b2代表肽段中N端前两个氨基酸组成的碎片离子，y2代表肽段中C端两个氨基酸组成的碎片信息，a图代表A1奶-酪蛋白含有特征肽段（LVYPFPGPIHN）的二级碎片离子图，b图代表A2奶-酪蛋白含有特征肽段（LVYPFPGPIPN）的二级碎片离子图。图 A.1（a）A1 奶-酪蛋白特征肽段(LVYPFPGPIHN)二级离子碎片信息（b）A2 奶-酪蛋白特征肽段(LVYPFPGPIPN)二级离子碎片信息
