GA T 1613-2019 法庭科学 生物检材中利多卡因、罗哌卡因和布比卡因检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法.pdf

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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 利多卡因 、罗哌卡因 和 布比卡因 检验 气相色谱 -质谱和液相色 谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for lidocaine, ropivacaine and bupivacaine in biological samples GC-MS and LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件

2、的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、广西公安厅刑侦总队 、 中国人民公安大学、 司法鉴定科学 研究院 、山西医科大学 。 本标准 主要 起草人：张蕾萍、 于忠山 、 杜鸿雁、 黄克建、刘晓锋、 河洪源、 张云峰、董颖 、栾玉静 、 刘伟、 沈敏、 贠克明 、王芳琳、何毅、李宏森 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中利多卡因 、罗哌卡因 和 布比卡因 检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了

3、 法庭科学 生物 检材 （血、尿、肝、肾 、胃及胃内容 等） 中 利多卡因 、罗哌卡因 和 布比 卡因 的气相色谱 -质谱（ GC-MS） 和 液相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量检验 方法。 本标准适用于 法庭科学 生物 检材 中 利多卡因 、罗哌卡因 和 布比卡因 的 定性分析和定量分析 。 其他 可 疑 样品中利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 的 定性分析和定量分析 可 参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实

4、验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对生物 检材 进行 提取、净化及浓缩 ， 采 用 气相 色谱 -质谱 法 和 液相色谱 -质谱法定性定量 ， 以保留时间 、 质谱特征离子碎片峰 和 相对丰度 比 作为定性判 断依据； 以 峰面积 为依据 ， 采 用外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 气相色谱 -质谱实验用水应 符合 GB/T 6682 中规定的三级水，液相色谱 -质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非

5、另有说明 ，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 二氯甲烷 ； b) 乙酸乙酯 ； c) 硼砂 ； d) 磷酸二氢钠 ； e) 磷酸氢二钠 ； f) 氢氧化钠 ； g) 甲醇 （色谱纯）； h) 乙腈 （色谱纯）； i) 甲酸 （色谱纯）； j) 醋酸铵 （色谱纯） ； k) 5%甲醇 -水 混合溶液 ； GA/T 2 l) 磷酸盐缓冲液（ pH 值 6） ： 称 取 8.812g 磷酸氢二钠 和 27.37g 磷酸二氢钠， 用 水溶 解并 定容 至 1000mL； m) 1%氢氧化钠溶液 ： 称取 1g 氢氧化钠 ， 用水溶解 并 定容 至 100mL； n) 0.1%甲酸 水 ：

6、 移取 0.5mL 甲酸 ， 用 水 稀释 并 定容 至 500mL； o) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 标准物质的纯度和盐型换 算后 ， 各 称取适量， 分别用甲醇配制 1.0mg/mL 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 标准物质 溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液 ； 2) 0.1mg/mL 混合 标准 工作 溶 液：移取 1.0mg/mL 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因标准物质 溶 液各 1.0mL，用甲 醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个月。 实验中所用其 他 浓度的

7、混合标准工作 溶 液均由 0.1mg/mL 混合 标准 工作 溶 液 用甲醇稀释得 到。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 固相萃取柱： Oasis HLB 固相萃取柱 或等效固相萃取柱 ， 使用前依次用 甲醇 3mL、水 3mL 活 化 ； 注： Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 d) pH 试纸 ： 范围 114； e) 一次性注射器 ； f) 有机系

8、微孔滤膜： 0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -质谱仪：配有电子轰击源（ EI）； b) 液相色谱 -质谱仪 ： 配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡 器； f) 移液器； g) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性 分析 7.1.1 样品 提 取 7.1.1.1 液液萃取 GA/T 3 移取血液等液体检材样品 1.0mL 2.0mL，或 称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 2.0g于具盖离心 管中，加 入 1%氢氧化 钠溶液调 pH值 至 9，振荡混匀，再加入 5mL 10mL二氯甲烷或乙酸乙酯，

9、振荡 10min， 8000r/min离心 10min， 分离有机相， 重复提取一次 ， 合并两次提取的有机相， 置于浓缩 器 上 50浓缩至 干 ， 残留物用甲醇 50L 100L溶解 ， 作为检材样品提取液供 GC-MS分析或 残留物 用 200L 1000L 甲醇 溶解 后，用 0.22m的有机系微孔滤膜过滤 ， 供 LC-MS分析。 7.1.1.2 固相萃取 (适 用 于新鲜 样品 ) 移 取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL， 或 称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 2.0g，加入 pH 值 6的 磷酸缓冲液 4mL 8mL， 振荡 15min， 8000r/min以

10、上 离心 20min， 取上清液转移至已活化好的固相 萃取柱中， 控制上清液过柱 ， 流速为 0.5mL/min 1.0mL/min， 用 5%甲醇水 3mL淋洗， 挤干水分或离心 或真空抽固相萃取 柱 2min， 用二氯甲烷 4mL洗脱， 收集洗脱液并 置于浓缩器上 50 浓缩至干， 残留物用 甲醇 50L 100L溶解，作为检材样品提取液供 GC-MS分析或 残留物 用 200L 1000L甲醇溶解后，用 0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供 LC-MS分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取 等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，

11、一份添加利多卡因、罗哌卡因和布比卡因标准物质，作为添加样品（ GC-MS添加样品的 浓度为 0.5g/mL(g)， LC-MS添加样品的浓度为 50ng/mL(g)）， 与检材样品平行操作，得到 空白样品提取 液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： DB-1MS 柱（ 30m0.32mm0.25m）或等效色谱柱； 注： DB-1MS 柱 是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示

12、对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程： 100保持 2min，以 15/min 速率升 至 280，保持 17min； c) 进样口温度： 280； d) 传输线温度： 230； e) 离子源温度： 200； f) 载气：高纯氦； g) 柱流量： 1mL/min 2mL/min； h) 进样方式 ： 分流进样 ， 分 流比： 5:1 50:1； i) 扫 描方式：全扫描（ SCAN） ， 质量扫描范围 40amu 450amu。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a

13、) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (2.1mm100mm， 1.8m)或等效色谱柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C18柱 是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相 ： A： 乙腈 ； B： 0.1%甲酸 水溶液 ； c) 洗脱方式： 梯度洗脱 ，梯度 见表 1； GA/T 4 表 1 梯度 洗脱条件 时间 min 流速 mL/min 流动相 A 流动相 B 0.1 0.4 20% 80% 2.5 0.4 70%

14、30% 2.8 0.4 70% 30% 2.9 0.4 20% 80% 5.0 0.4 20% 80% d) 离子源：电喷雾电离源（ ESI） ； e) 检测 方式：正离子 ； f) 扫描 方式：多反应 离子 监测 （ MRM） ； g) 电喷雾电压： 5500 KV； h) 离子源温度： 650； i) 雾化气压力： 55psi； j) 气帘气压力： 30psi； k) 辅助气压 力： 50psi； l) MS 参考条件（定性 、 定量离子对和 去簇电压、碰撞能 量） 见表 2。 表 2 MS 参考 条件 名 称 保留时间 min 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 利多卡

15、因 1.29 235.1 85.6 235.1 85.6 110 33 235.1 58.1 110 50 罗哌卡因 1.66 275.2 126.1 275.2 126.1 90 27 275.2 84.0 90 55 布比卡因 1.88 289.1 140.1 289.1 140.1 80 30 289.1 98.1 80 48 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 5.0mL， 或称取铰碎的 肝脏等 固体检材样品 1.0g 5.0g 两

16、份 ， 按 7.1.1 进行操作。 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 标准 物质 作 为添加样品 （ 添加样品中目标物含量应为检材 样品 中目标物含量的 (10030)%），另一份 作为空白样品， 与 检材 样品平行 操作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 GA/T 5 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液，按 7.1.2.1 的 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度

17、，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 2 3次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g ） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升

18、 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（ 2）计算相对相差 ： %10 0X XXRD 21 = . (2) 式中： RD 相对相差，用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 气相色谱 -质谱 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱

19、特征离子与标准溶液 一致，特征离子丰度比与浓度接近 的标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰， 则可判断检材样品中检出目标物。 GC-MS 相关谱图参见附录 A 中的图 A.1 图 A.4。 表 3 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 本方法中 GC-MS 的检出限 参见 附录 A 中的 表 A.2。 8.1.2

20、液相色谱 -质谱 GA/T 6 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度 比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品 中检出目标物。 LC-MS的相关谱图参见附录 A中的图 A.5。 表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标

21、准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 本方法中 LC-MS 的检出限 参见 附录 A 中的 表 A.2。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验 。 8.3 相关资料 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 的分子式、分子量、小鼠 LD50等相关资料 参 见附 录 A 中的 表 A.1。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 相关资料及谱图 A.1 利多卡因、罗哌卡因 和 布比卡因的相关资料 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因均属

22、于酰胺类局麻药 ， 用于手术麻醉， 它们的分子结构中均含苯胺、 胺基等碱性基团 。此类毒物中毒一般由于操作失误造成。 中毒反应表现为： a) 立即毒性反应，多见于注入血管所致 。 小剂量的局麻药数秒钟即可发生神经阻滞反应尤其头颈 部， 若 星状神经节阻滞误入血管，给药数毫升即出现意识丧失、惊厥等中枢神经毒性症状 ； b) 延迟性毒性反应， 多见于 过量局麻药注入 血管外吸收所致，给药 （ 5 30） min 出现临床症状， 主要为中枢神经及心血管系统的表现。 如 头痛、头晕、共济失调、面红，继之耳鸣、视物模糊、 多语兴奋状态，窦缓、窦性停搏及房室传导阻滞 等 。 这 三 种毒物的分子式、分子量

23、、小鼠 LD50及气质定量离子 见表 A.1。 表 A.1 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 的 分子式、分子量、小鼠 LD50及气质定量离子 利多卡因 罗哌卡因 布比卡因 分子式 C14H22N2O C17H26N2O C18H28N2O 分子量 234 274 288 小鼠 LD50 mg/kg 153.3 46.5 62.7 GC-MS 定量离子 m/z 86 126 140 A.2 利多卡因、罗哌卡因、布比卡因的相关谱图 利多卡因、罗哌卡因、布比卡因的相关谱图 见图 A.1A.5。 图 A.1 血添加的 GC-MS 总离子流图 GA/T 8 100 200 300 400 0 . 0 2

24、5 . 0 5 0 . 0 7 5 . 0 1 0 0 . 0 % 86 58 42 120 234148 185 264 355 434393322 图 A.2 利多卡因质谱图 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 . 0 2 5 . 0 5 0 . 0 7 5 . 0 1 0 0 . 0 % 126 8456 41 98 149 239 382 439186 252 309 332207 405365280 图 A.3 罗哌卡因质谱图 5 0 . 0 7 5 . 0 1 0 0 . 0 1 2 5 . 0 1 5 0 . 0 1 7 5 . 0 2 0

25、0 . 0 2 2 5 . 0 2 5 0 . 0 2 7 5 . 0 3 0 0 . 0 3 2 5 . 0 3 5 0 . 0 3 7 5 . 0 4 0 0 . 0 4 2 5 . 0 4 5 0 . 0 0 . 0 2 5 . 0 5 0 . 0 7 5 . 0 1 0 0 . 0 % 140 56 8441 98 120 263 371190 409227 345214 283 392 445171 331302 图 A.4 布比卡因质谱图 GA/T 9 图 A.5 利多卡因、罗哌卡因和布比卡因 LC-MS 的提取离子流图 A.3 利多卡因、罗哌卡因、布比卡因的 相关数据 血液 中利 多卡因、罗哌卡因、布比卡因检出限 见表 A.2。 表 A.2 血液 中 利多卡因、罗哌卡因、布比卡因 的检出限 单位为 纳克每毫升 （ ng/mL） 药物名称 利多卡因 罗哌卡因 布比卡因 气相色谱 -质谱法 GC-MS 20 20 20 液相色谱 -质谱法 LC-MS 1 0.1 0.1 A _ 罗哌卡因 利多卡因 布比卡因