GB T 18420.2-2009 海洋石油勘探开发污染物生物毒性.第2部分 检验方法.pdf

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1、ICS 1303020Z 17 a园中华人民共和国国家标准GBT 1 842022009代替GBT184202 2001海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法Biological toxicity for pollutants from marine petroleum explorationand exploitation-Part 2：Test method20090311发布 20091101实施宰瞀鹃鬻瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19GBT 1 842022009目 次前言。1范围-2规范性引用文件3术语和定义4原理-5采样、送样和样品保存。6实验生物7设施和设备

2、8试验程序9试验结果分析和判断10质量控制11检验报告附录A(资料性附录) 生物毒性试验结果原始记录表附录B(规范性附录)生物毒性试验结果判定流程图，附录C(资料性附录)LC。和EC。的计算方法附录D(资料性附录) SpearmanKarber计算法和Trimmed SpearmanKarber计算法附录E(资料性附录) 正态性检验和方差齐性检验附录F(资料性附录)Dunnetts检验和SteelS多对一秩检验附录G(资料性附录)生物毒性检验报告表一参考文献一工111122346667un毖拍卯目U 昌GBT 1842022009海洋石油勘探开发污染物生物毒性分为两个部分：第1部分：分级；第2

3、部分：检验方法。本部分为第2部分。本部分代替GBT 184202 2001海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法。本部分与GBT 184202 2001相比主要变化如下：将“96 h换水式生物毒性试验”的术语和定义修改为“静水式生物毒性试验”的术语和定义(2001年版的32，本版的31)，增加了“半数有效浓度”的术语和定义(本版的34)；在“采样、送样和样品保存”一条中增加了关于“基液”的内容(本版的511和5122)；在“实验生物”一章增加了4种实验生物及其相关内容(本版的6164)；增加了“基液”和“合成基钻井液”的贮备液配制方法(本版的81213和8122)；增加了以生长作为观测指标的生

4、物毒性试验方法的相关操作(本版的84622)；修订了“结果的有效性”的部分内容(2001年版的101，本版的91)；在附录中增加了部分数据处理和结果计算的方法示例，以及生长毒性试验的原始记录表(本版的附录A附录F)。本部分的附录B为规范性附录，附录A、附录c、附录D、附录E、附录F、附录G为资料性附录。本部分由国家海洋局提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SACTC 283)归口。本部分起草单位：广东省实验动物监测所、国家海洋局南海分局。本部分起草人：黄韧、魏社林、吴进孝、郑琰晶、王颖、王国栋、周锦。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1842022001。海洋石油勘探开发污染物

5、生物毒性第2部分：检验方法GBT 18420220091范围本部分规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的部分污染物在生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、实验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。本部分适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的钻井液、基液、钻屑和生产水的生物毒性检验，本部分限定外的污染物的生物毒性检验可参照使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版

6、本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB 173783海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB 1737842007海洋监测规范第4部分：海水分析3术语和定义下列术语和定义适用于本部分。31静水式生物毒性试验static biological toxicity test试验期间内不更换试验溶液，进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验。32无可见影响浓度IlO observed effect concentration(NOEC)实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后，通过观察实验生物的不良影响，并比较试验组与对照组统计分析结果，判定出对实验生物无显著影响的最大浓度

7、。33半数致死浓度half lethal concentrationLC5。在一定观察期内，造成50的受试生物死亡的毒物浓度。GB 1737872007，定义31034半数有效浓度half effective concentrationEc5。在一定观察期内，引起50受试生物产生某一特定效应，或者是实验生物的某效应指标被抑制一半时的毒物浓度，以ECs。表示。4原理海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响，通过观察测定实验生物在一定试验期间内接触试验物质后的异常或死亡效应，得到海洋石油勘探开发荇染物对实验生物有明显影响的具体浓度。1GBT 1 8420220095采样、送样和样品保存51样品的采集5

8、11采样数量采样量：钻井液5 L，基液5 L，生产水5 L；采样量应足够供3次重复试验的用量。512采样地点5121钻井液样品从排放口或泥浆池采集。5122基液样品采自贮存基液。5123生产水在排放点的排放口采样。52包装、运输和贮存521包装采送样品应用惰性材料制成的容器密封包装，如聚乙烯塑料桶。522运输按照GB 173783的规定贮存和运输样品，受检样品应在48 h内送达生物毒性实验室。523标签所有样品容器上应标明样品名称、钻井代号、油井代号、生产或使用者、采样人、采样时间、采样方式、采样数量等。样品送达实验室后送样人应填写送样表，样品接受人应检查样品标签和包装是否完整，并对样品进行编

9、号、签字和记录存档。524贮存生产水样品应贮存于48，其他样品应贮存在阴凉处。6实验生物61实验生物的种类611 仔虾：中国明对虾(FPnnPropPn口e“5 chinensis)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)、脊尾白虾(Palaemon carincauda)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)五种虾的仔虾。612卤虫(Artemia)613蒙古裸腹潘(Moina mongolica)614裸项栉虾虎鱼(Ctenogobius gymnauchen)62实验生物来源及品质621仔虾仔虾宜实

10、验室自繁饲养，也可自货源稳定、信誉好的苗种场购买。仔虾购入后应在实验室驯养48 h后用于毒性试验，自繁饲养的仔虾应驯化24 h后用于毒性试验。应选活力好，体色透明的仔虾用于试验。622卤虫可实验室自繁收集卤虫，也可购买商品卵孵化：按10 gL的比例取适量卤虫卵加入稀释水中，在25、盐度3035、光照2 000 lx3 000 lx的环境条件下充氧孵化。应取同一批次孵出的无节幼体用于毒性试验。623蒙古裸腹漫宜实验室自繁收集。624裸项栉虾虎鱼宜实验室自繁收集。263实验生物饲养条件631仔虾仔虾饲养的适宜条件见表1。表1仔虾实验室饲养条件cBt 1842022009饲养条件 中国明对虾仔虾 斑

11、节对虾仔虾 长毛明对虾仔虾 脊尾白虾仔虾 凡纳滨对虾仔虾水温 2225 27-29 2629 2428 2330盐度 2533 2833 2530 2228 828pH 7682 7682 7682 7986 8083632卤虫在水温2227、盐度3035、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单胞藻。633蒙古裸腹漫在水温2227、盐度2630、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单胞藻。634裸项栉虾虎鱼实验前1周采收受精卵并置于水温2728、盐度2532、pH7682条件下充气孵化，收集初孵仔鱼并记录孵出El期，同一批收集的仔鱼孵出时间间隔不能超过24 h。仔鱼

12、的饲养条件为水温2530、盐度2030，自然光照，2日龄投喂轮虫，15日龄后可投喂卤虫幼体或轮虫。64 实验生物开始试验的日龄和观测指标641仔虾：小于仔虾期10 d(P，。期)的仔虾，以死亡做观测指标。642卤虫：卤虫卵孵化20 h24 h的幼体，以死亡或生长做观测指标。643蒙古裸腹潘：I龄幼体，以死亡做观测指标。644裸项栉虾虎鱼：3日10日龄的仔鱼，以死亡做观测指标。65实验生物的质量控制651实验生物应健康正常，驯养阶段的死亡率应小于10。652应进行标准毒物对实验生物的24 h急性毒性试验，建立各批次实验生物的24 hLCs。范围，本试验所用标准毒物为分析纯的十二烷基硫酸钠(sod

13、ium dodecyl sulfate，SDS)。7设施和设备71设施711饲养实验生物的水池或水族箱等。712可控照明装置。713饲养实验生物的控温、充氧、循环清洁海水的设备，包括制冷和加热的控温设备、充气设备、循环水设备、水过滤设备等。72试验容器及溶液体积721仔虾试验溶液体积应为1 000 mL，试验容器可采用玻璃水槽等玻璃容器。722 卤虫无节幼体试验溶液体积应为100 mL，试验容器可采用烧杯等玻璃容器。723蒙古裸腹潘试验溶液体积应为100 mL，试验容器可采用烧杯等玻璃容器。724裸项栉虾虎鱼仔鱼试验溶液体积应为200 mL，试验容器可采用烧杯、水槽等玻璃容器。73环境因子测定

14、的试剂和仪器溶氧仪、盐度计、pH计、温度计。也可采用分光光度法测定溶解氧含量，测定的试剂和仪器应符合GB 1737842007第32章的规定。3GBT 1 84202200974其他高速搅拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网、酶标板或者小离心管等。8试验程序81检验样品的准备811稀释水的准备稀释水应清洁、无毒、水质稳定且对实验生物适宜，宜使用取自清洁无污染海区水质稳定的海水作为稀释水。若条件不许可，可使用人工配制海水，配制成与纳污水体相同的盐度后使用。812贮备液的配制8121钻井液贮备液的配制81211水基钻井液按体积比取1份钻井液加入9份稀释水，2 000 rmin3 000 rmin搅

15、拌15 rain，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5 rain，静置60 min后取上层悬浮液作为贮备液。81212油基钻井液按体积比取1份钻井液加入9份稀释水，2 000 rmin3 000 rrain搅拌15 h至絮状，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5 min，静置60 rain后，避开表面油膜，取水相部分作为贮备液。81213合成基钻井液按81212的规定配制。8122基液贮备液的配制按81212的规定配制。8123生产水贮备液的配制取一定体积的生产水加入稀释水中，2 000 rmin搅拌15 rain，配制成预定浓度的贮备液。82组织固定液的配制821固定液的使用固定

16、液用于以生长做观测指标的生物毒性试验中生物个体的组织固定。固定液可采用中性甲醛固定液(35)或鲁哥氏液。822 中性甲醛固定液(35)以pH 7274的磷酸缓冲液为溶剂配制，配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。3中性甲醛固定液配方：蒸馏水925 mL，加入无水磷酸氢二钠65 g，及磷酸二氢钠40 g，充分溶解后加入甲醛(40)溶液75 mE。5中性甲醛固定液配方：蒸馏水875 mL，加入无水磷酸氢二钠65 g，及磷酸二氢钠40 g，充分溶解后加入甲醛(40)溶液125 mL。823鲁哥氏液鲁哥氏液又称碘液，配制方法：取6 g碘化钾溶于20 mL蒸馏水中，搅拌到完全溶解后，加入4

17、g碘，等碘充分溶解后，加入80 mL蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。83预备试验宜选用2种或2种以上的实验生物进行试验。以死亡率为观测指标的预试验应尽量确定出全部死亡和无死亡的浓度范围，以生长为观测指标的预试验应确定出能引起50以上(低于100)作用效果和50以下(高于0)作用效果的浓度范围。具体操作按照84。84正式试验841试验浓度设置用贮备液和稀释水配制试验溶液，参考预试验结果设定5个等比浓度组和1个空白对照组，等比系数不宜大于20，每个试验组应设4个重复，每个容器应放lo个实验生物个体。如果样品毒性较低，则应保证试验死亡数据至少能满足计算LC；。或EC；。的最低要求。4GBT 184202

18、2009842实验生物移入8421仔虾用手抄网在驯养池中随机选择实验生物并及时放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验操作过程中，应在30 rain内完成分放实验生物。8422卤虫用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移人试验容器。尽量减少分放实验生物的时间，尽量减少生物移入过程中对各浓度组试验溶液的稀释。8423蒙古裸腹漫按照8422规定的方法操作。8424裸项栉虾虎鱼仔鱼按照8422规定的方法操作。843充气要求当试验溶液的溶解氧饱和度低于60时，应对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为60个min100个rain。如浓度组进行充气，同样对照组也应充气。844试验的环境因子试验适宜

19、的环境条件为：水温2328，盐度2035，pH7686。试验过程中水温变化范围不应超过2，盐度变化范围不宜超过2，pH值变化范围不宜超过04。845饲喂8451仔虾宜饲喂卤虫无节幼体，每个仔虾每天饲喂10个卤虫无节幼体。8452卤虫幼体和蒙古裸腹潘饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂(离心转数3 000 rmin4 000 rmin)，避免加入藻液引起试验溶液体积的明显改变。8453裸项栉虾虎鱼仔鱼宜饲喂轮虫，每条仔鱼每天投喂500个轮虫，每个试验容器投喂体积不超过02mL。846观察和记录8461仔虾毒性试验持续时间为96 h，每24 h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在

20、原始记录表内，见表A1。轻触无反应或在体视显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。8462卤虫84621以死亡为观测指标的毒性试验，持续时间为96 h，每24 h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A1。沉到容器底部的幼体在15 S内仍不能游动者，即认为已死亡。84622以生长为观测指标的毒性试验，持续时间为72 h。72 h时用吸管吸出存活个体置于酶标板或离心管中，加入鲁哥氏液或中性甲醛固定液(3-5)固定后，吸出卤虫置载玻片上，在4倍物镜下用目镜测微尺观测体长，或使用显微镜摄像系统的软件进行体长测量，卤虫体长为尾凹到头部的最长距离。将体长观测值记录在原始记录表内

21、，见表A2。8463蒙古裸腹涵毒性试验持续时间为72 h，每24 h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A1。沉到容器底部的蒙古裸腹潘在15 S内仍不能游动者，即认为已死亡。8464裸项栉虾虎鱼仔鱼毒性试验持续时间为96 h，每24 h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A1。体色不透明或身体弯曲，且用胶头滴管轻吹无反应的判为死亡个体。8465环境因子的测定和记录每次试验溶液配制后应测定并记录各项环境因子，如溶解氧、pH值、水温、盐度等，结束试验时宜5GBT 1842022009相应地测定并记录这些环境因子。测定值记录在原始记录表上，参见

22、附录A。9试验结果分析和判断91结果的有效性试验溶液的溶解氧饱和度应达到60以上。以卤虫作为实验生物的试验，对照组的死亡率不超过10；以仔虾及仔鱼作为实验生物的试验，对照组的死亡率不超过20。92试验结果的判定921试验结果判定流程试验结果判定流程见附录B。922 以死亡为观测指标的生物毒性试验9221在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现实验生物死亡，直接判定为大于生物毒性容许值。9222当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过概率单位法、图表法等方法计算LC5。值。概率单位法、Spearman-karber法和Trimmed Spearman-karber法计算LC5。

23、值和置信区间，作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录c和附录D。9223在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过计算NOEC值辅助判定受检物的生物毒性。对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，参见附录E，如符合正态检验和方差齐次检验则采用附录F的参数检验方法(Dunnetts检验)判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验则采用附录F的非参数秩检验方法(Steels多对一检验)判定NOEC值。923 以生长为观测指标的生物毒性试验通过线性内插法计算E，以ECs。值作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录c；可以通过计算NOEC值来辅助判定受检物的生物毒性，按9223规定的

24、方法计算。10质量控制101 批间和批内质量控制1011每批次试验必须同时进行标准毒物的24 h生物毒性试验，通过比较LC。值评价实验生物质量的稳定性。1012保证试验过程试验环境因子的稳定性，即试验期间的水温变化不应超过2，盐度变化不宜超过2，pH变化范围不应超过04，溶解氧饱和度应大于60。102原始记录原始记录应完整，包括采样的时间和地点、试验时间、样品的保存方法、采样和试验人员签名、试验所用的方法和技术、质量控制记录、试验的原始资料、仪器校准和维修记录、试验报告等。11检验报告检验报告应包括检验报告表和试验报告。检验报告表包括：送样单位、送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人

25、、检验依据的标准、试验结果、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式参见附录G。不同试验的检验报告应分别撰写。试验报告包括：受试样品表观描述；稀释水、贮备液和试验溶液的配制；试验所用仪器设备；实验生物介绍；对照组和各个浓度组死亡数；用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度与实验生物反应的关系；检验人签名。附录A(资料性附录)生物毒性试验结果原始记录表表A1为生物死亡毒性试验结果原始记录表。表A2为生物生长毒性试验结果原始记录表。表A1 72 h96 h静水式生物死亡毒性试验原始记录表受试物质： 样品编号： 送样单位：实验生物： 送样日期： 试验日期：检验依据： 样品表观性状GBT

26、 1842022009对照组 组1： mgL 组2： mgL时间 项目A B C D A B C D A B C D存活数水温0 h 盐度PHDOmgL存活数水温24 h盐度存活数48 h 水温 盐度存活数72 h 水温 盐度存活数水温96 h 盐度pI-IDOmgLGBT 1 842022009受试物质实验生物样品编号送样日期检验依据： 样品表观性状表A1(续)送样单位试验日期组3： mgL 组4： mgL 组5： mgL时间 项目A B C D A B C D A B C D存活数水温0 h 盐度PHDOmgL存话数24 h 水温 盐度存活数水温48 h盐度存活数永温72 h盐度存活数水温

27、96 h 盐度pHDOmgL8检测人 复核人受试物质实验生物表A2 72 h生物生长毒性试验原始记录表样品编号送样日期检验依据： 样品表观性状送样单位试验日期GBIT 1 842022009对照组 试验组1： mgL 试验组2： mgL时间 项目A B C D A B C D A B C D水温盐度O hpHDOmgL水温24 h 盐度水温48 h盐度水温盐度pHDOmgL1272 h 34体长 5mm 6789109GBT 1842022009受试物质实验生物样品编号送样日期检验依据： 样品表观性状表A2(续)送样单位试验日期试验组3： mgL 试验组4： mgL 试验组5： mgL时间 项

28、目A B C D A B C D A B C D水温盐度0 hpHDomgL水温24 h 盐度水温48 h 盐度水温盐度pHDOmgL1272 h 34体长 5mm 67891010检测人 复核人附录B(规范性附录)生物毒性试验结果判定流程图图B1、图B2、图B3为生物毒性试验结果判定流程图。GBI1842022009图B1 以死亡为观测指标的生物毒性试验结果判定流程图B2 LC。o的计算流程GBT 184202200912图B3以生长为观测指标的生物毒性试验结果判定流程附录C(资料性附录)Lc50和Ec50的计算方法GBT 1842022009C1 LC。的概率单位计算法C11一组生物毒性试

29、验的数据如下，将试验的原始数据进行浓度对数转换、死亡率查表转换为概率单位，列表见表C1计算表。表c1计算表浓度 实验生物数n 死亡数r 死亡率 浓度对数x 概率单位135 0130 3 40 12 30 448180 0255 3 40 24 60 525240 0380 2 40 28 70 552320 05051 40 36 90 628420 0623 2 40 40 100对照 40 O 0若对照组出现死亡时还要对各个试验组的数据进行校正，按式(c1)进行(本例中无需进行此步骤)：户：一(声；一声：)(1 p：) (C1)式中：掰经过校正的第i组的死亡率；观察的第i组的死亡率；“对照

30、组的死亡率。c12以表c1中的浓度对数x为横轴，概率单位为纵轴做散点图，按照最小二乘法划出拟合直线(图C1)，标出概率单位为5时的浓度对数lgLC；。，本例中19L c5。一024，求反对数得LCs。为174。死亡概翠 一线性(死亡穰翠)图C1 浓度对数和死亡概率单位关系图c13求浓度一反应的回归方程。c131在直线上取距离较远的两个点，如取概率单位4(，)和6(y：)，然后在图中读出相应的z，一0035和zzo445，按式(c2)计算斜率b，为4878。b一(y2一Y1)(z2一z1) (C2)】37565554654GBT 1 842022009C132将b值和lg LCs。值代入式(c3

31、)，计算得浓度一反应的回归方程。YY+b(xX) (C3)式中：，任一浓度组的期望概率单位；y概率单位5；z概率单位为y时的浓度对数；x 概率单位为5时的浓度对数。本例中：64878Xo24y一5+4878(z一024)一4878x+3829C14 z2检验z2检验的公式：Z2一(r一印)2p(1一p) (C4)式中：n实验生物数；r死亡数；p期望死亡率；np期望死亡数。列出回归线检验表，见表c2。本例中自由度为2，查表得菇。s一599，而回归线的2=1339 6，艋。sz2，所以回归线符合检验。表C2回归线的r检验表P !二翌芷：n声 (p)2 np(1声)np(1一p)0130 3 40

32、12 4464 9 29 116 O4 016 8236 0019 4O255 3 40 24 5074 2 53 212 28 784 9964 0786 8O380 2 40 28 5683 9 75 300 2o 400 7500 o533 305051 40 36 6293 2 90 360 0 O 3600 Or 1339 6C15求lg Lc5。的均数的标准误c151按式(c5)求标准差S，为0205。S一1bc152按式(c6)求均数的标准误s。，为0026 5。S。一s4nt2式中：n死亡概率单位在46范围内所用的动物数。C16求LC。的置信限：按式(c7)求出】gLG。的95

33、置信限的对数值，为o188 1o291 9，然后取反对数得LC；。的95置信限为1542 11958 4。95置信限一lg LC5。士196s。(C7)C2 EC5。的线性内插计算法c21 以某个生产水样品对卤虫生长的毒性试验为例，说明EC；。的计算方法，试验结果见表C3。该14GBT 1842022009试验共设五个浓度组和一个对照组，每个浓度组设六个重复处理，每个重复下10只卤虫，将一个重复下的10只卤虫体长取平均值，即得该重复下的平均体长。如果某个重复下出现死亡个体，则将存活个体的体长总和除以10，即为该重复下的平均体长。C22平均值平滑处理C221以线性内插法计算EC；。需满足的前提是

34、，随浓度增加，各浓度组观测值(体长)递减。因此在计算EC。之前，需对各浓度组的平均值进行平滑处理。处理前的平均值以yi表示，处理后的平均值以M：表示。C222本例中，再瓦，则Ml一一Y1，接着比较再和霹，再W(n，a)则资料服从正态分布；若wW(n，a)，则资料不服从正态分布。本例中a一005，n=24，临界值Wc：。s，一0916W=0974，因此本次毒性试验数据符合正态分布。E2 Bartletts检验E21原理和适用范围BartlettS检验用于多个样本方差的齐性检验，通过比较各个试验组的总体均数的变异来判定它们之问的差异是否有统计学意义。在本试验中，一个样本指试验组中的一个重复，样本观

35、测值指经过反正弦方根变换的数值。该方法所计算的统计量近似服从于z2分布。E22一组96 h毒性试验结果(见表E1)经正态检验后证明服从正态分布，然后依据式(E3)、(E4)、(E5)计算B值： IB一(In可一filnS21)C “(E3)j、，工。，【1一lf广。rL妇1一任口v+1一C 亨一(s；)，tffil l=l式中：各试验组的自由度，一(豫一1)；ni每个试验组的重复数；GBT 1842022009i包括对照组在内的试验组数(1，2，)；S；各试验组的方差；C校正系数。计算得BE181n(0023 7)一3lnS；1129 6t一1一18(-3742 4)一3(一24737 8)1

36、129 66064E23当多个样本满足方差相齐时，B值近似服从自由度为(一1)的分布。当自由度为5，显著性水平为001时，查表得临界值为15086。由于B一6064，差异不显著，故方差相齐。GBT 1842022009F1 Dunnetts检验附录F(资料性附录)Dunnetts检验和Steels多对一秩检验F11原理和适用范围Dunnetts检验通过比较各试验组均数和对照组均数来判定两者之间是否有统计学上的差异。本分析方法适用于毒性试验的原始数据符合正态和方差齐次检验后的数据分析。把一组96 h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、总和和平均值列表，见表F1。表F1 96 h毒性

37、试验存活数据表试验组对照组重复 ragLmgL32 64 128 256 512A 10 08 09 09 07 04B 10 08 10 O9 09 03原始数据C 09 10 10 O8 10 04D 09 08 10 10 05 02A 1412 1107 1249 1249 099l 0685反正弦 B 1412 1107 1412 1249 1249 0580方根转换 C 1249 1412 1412 1107 1412 0685D 1249 1107 1412 1412 0785 0464总和丁 5322 4733 5485 5017 4438 2413平均值X 1331 1183

38、 1371 1254 1109 06031 2 3 4 5 6G=T 11319F12建立ANOVA(方差分析)计算表，见表F2。表F2 ANOVA计算表方差来源 自由度v 离均差平方和SS 均方MS-SSy组间 P15 SSB SB2组内 NP一18 SSw SW2总数 N123 SST22表中各项的计算公式为SSB一T2n。一GzNl=】p “，SST一碍一G2N 1=1SsWSsTssBSB 2一SSB(声一1) 234FFFvvv式中：户试验组和对照组的总数；N样本含量；ni第i组。本例中：”1712一n3一”4一”5一”64N一24G一L一27408iIpSSB一T；啦一G2Ni=l

39、一1314954274082z4一】574SW2一SSW(Np)GBT 1842022009“(F5)SST一玛一酽N ll一33300274082242000sSWsSTSSB=200015740426 0SB 2一SSB(P一1)=1574(61)一0315 0SW 2一SSw(Np)一0426(246)一0024F13 t值的计算，按式(F6)进行。按式(F6)计算t值：t一(再一E)怕而5可巧i订万万 (F6)式中：y，对照组的平均存活率；y，第i试验组的平均存活率；n。对照组的重复样；琏试验组的重复样。数据代人式(F6)为：t：一(13311183)瓦面夏巧n7r干i万了一1351计

40、算得各浓度组的t值(表F3)。表F3 t值计算表污染物浓度flmgL32 2 135164 3 0365128 4 0703256 5 2027512 6 664623GBT 1842022009F14方差分析T介值表(见表F4)使用举例。当a一005时，查表F4可知t。值为241。那么t5241，从而判定NOEC为256 mgL。表F4方差分析(Dunnetts test)T介值表ao05单侧检验vn 3 4 5 6 7 815 224 236 244 251 257 26216 223 234 243 250 256 26117 222 233 242 249 254 25918 221

41、232 24l 248 253 25819 220 231 240 247 252 25720 219 230 238 246 251 256F2 Steels多对一秩检验F21原理和适用范围Steels检验将各试验组和浓度组编秩后，通过比较各浓度组和对照组的秩和来判定两者之间是否有统计学的差异。本分析方法适用于毒性试验的原始数据不符合正态检验和方差齐次检验后的数据分析。F22分析步骤F221 把一组96 h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和标准离差列表，见表F5。F222把每个对照组和试验组的数据进行合并，然后将对照组和每个试验组的数据从小到大排序，统一编秩(1，2，

42、)。当数据相同时，秩次取位置序数的平均值；最后把所有排序结果列表，并计算每个试验浓度组的秩和。见表F6秩计算表。F223本例检验水平a为005，试验组数(除对照组)为4，查表F7，T口一10，只有1个试验组的秩和值等于L，而其余试验组的秩和值均大于L，所以本例中NOEC为lo。符合生物毒性容许值。表F5平均值和标准离差计算表试验组对照组重复 18 32 56 lOA 1o 1o 1o 10 o8B 1o 1o 1o 1o o8原始数据C 1O 1o 1o 1o 07D 1o 09 1O 08 O6A 1412 】412 14】2 】412 】07反正弦 B 1412 1412 1412 1_4

43、12 1107方根变换 C 1412 1412 1412 1412 o991D 1412 1249 1412 1107 o886平均值 1412 1371 1412 1336 1023离差 O0 o006 Oo o023 o0111 2 3 4 5表F6秩计算表GBT 1842022009试验组对照组重复 18 32 56 10A 1412(5，45，5，65) 1412(5) 1412(45) 1412(5) 1107(35)B 1412(5，45，5，65) 1412(5) 1412(45) 1412(5) 1107(35)C 1412(5，45，5，65) 1249(1) 1412(45) 1412(5) 099l(2)D 1412(5，45，5，65) 1412(5) 1412(45) 1107(1) 0886(1)秩和 16 18 16 10表F7 T介值表试验组数(不包括对照组)重复样2 3 4