GB T 16285-1996 食品中葡萄糖的测定方法 酶-比色法和酶-电极法.pdf

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1、GB/T 162部1996前主口食品中葡萄糖的测定方法，一般采用4国际食糖分析方法统委员会规定的兰-埃农法(Lane and Eynons method)和姆松华尔格法(Mun回nand Walkers method)，那菲林氏溶液氧化还原满定法。此法虽沿用已久，但测定结果只是近似值。因使用菲林民溶液滴定葡萄糖(还原糖时，其他具有还原能力的单糖会干扰测定结果.本标准采用的酶比色法和酶-电极法是在检索了近20年107篇国外文献的基磁立，经过反复实验、验证商制定的。费每哈比色法和毒草电极法使用的葡萄糖氧化酶(GOD)具有专一性，只能催化葡萄糖水溶液中的-D-葡萄糖起反应(被氧化)，因此测定结果是真

2、实值。本标准的酶币比色法为仲裁法g醒醒-电极法为快速法。本标准的附录A、附录B都是标准的精渎。本标准由全阂食品工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位z中E疆农垦北方食品监测中心董事比色法h山东省科学院生物研究所酶-电极法)。本标准经全阔食品工业标准化技术委员会秘书处审核。本辛辛、准主要起草人s张宗城、文写字、冯德荣、孙士膏、宋家华、篇短。327 1 范副中华人民共和国回家都准食品中葡萄糖的湖定方法酶-比色法和酶吟电极法Method for determlnat如nof gluco皿Inr崎d一Enzyme-colorlmetrlcmetlt础皿denzy酷e-ol耐rodemethod

3、 本标准规定了用酶-比t5法和酶电极法型d定食品中葡萄糖的方法。G/T 16285-1996 本标准适用于各类食品中葡萄糖的测定，亦适扇子食品中其他级分转化为葡萄糖的测定。本标准酶与比包法的最低检出限量为0.01g(葡萄糖)/mL(试液h酶电极法的最低检出限量为1.0四g/100mL. 2酶-比法2.1 原王军葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下，催化D-葡萄糖葡萄糖水溶液状态)氧化，生成。葡萄糖酸心内酶和过氧化氮.受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯盼生成红色ft亚艘。在波长505nm处测定酿豆R茸的吸光度，计算食品中葡萄糖的含量C，HI2O，+O，旦C，HO，+H，O，

4、H，O，+C，H，O日+CllHN，OPOl!c杰事NO十H，O2.2试:1ft!2.2.1 级会试教!鑫1号子瓶z内含O.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH= 7.0) 100 mL.其中中氨基安替比林为队00154 mollL! 2号葬在2内含在.022mol/L苯酸溶液10号mL;3号瓶z内含葡萄糖氧化酶(gucoseoxidase) 400 U (活力单位)、过氧化物前(辣根，peroxidase) 1000 U(活力单位1、2、3号瓶须在4C左右保存。2.2.2 酶试剂溶液z将1号瓶和2号瓶的物质充分混合均匀，再将3号瓶的物质溶解其中，轻轻撼动勿黯然撼动).使德萄糖氧化酶和过氧化物毒

5、草完全溶解。此浓浓须在4C左右保存，有效骂ij1个月。2.2. 3 0.085 mol/L亚铁辄化饵溶液=称取3.7g亚铁氟化梆K，Fe(CN)， 3日，GB1273.分析纯 溶于100mL重蒸馆水中，撼匀。2. 2. 4 O. 25 mol/L硫酸辛辛溶液g称浓7.7g硫酸辛辛(ZnSO， 7日.GB666.分析船，溶于100mL霆蒸饱水中，摇匀。2.2.5 O. 1 mol/L氢氧化锁溶液s称取4g氮氧化锵(GB629，分析纯).溶于1000mL重蒸惚水中，摇匀。2. 2. 6 葡萄糖标准溶液:称取经100土ZC烘烤Zh的葡萄糖HG3-1094.分析纯)1.000 0 g.溶于熏理家技术监

6、督局1996-04-10批准1996-12-01实施328 GB/T 16285一1996蒸馆水中，定容至100mL.摇匀。将此溶液用重蒸馆水稀释V，一V100即为200吨/mL葡萄糖标准溶液。2.3 仪器和设备实验室常规仪器及下列各项22. 3. 1 研钵或粉碎机。2. 3. 2 分析筛。2. 3. 3 组织捣碎机。2. 3. 4 恒温水浴锅。2. 3. 5 吁见光分光光度汁。2. 3. 6 微量移液管，1.00 mL.精度0.01mL 2. 4 试样的制备2.4.1 阔体样品粉末状样品取有代表性的样品至少200g.充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。颗粒状样品.取有代表性的样品至少200g.用

7、粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。新鲜水果、蔬菜等固体样品z取有代表性的可食部分至少200g.用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。2.4.2 糊状样品取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。2.4.3 罔液体样品取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。2.4.4 液体样品取有代表性的样品至少200mL，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。如样品中含二氧化碳，须用三角瓶取200mL，旋摇至基本无气泡，安装冷凝管，置沸水浴中加热10min，取出冷却至室温。2. 5 试液的制备2. 5. 1 不含蛋白质的试样:用1

8、00mL烧杯称取试样(2.4)110 g(精确至O.000 1 g).加少量重蒸馆水，转移到250mL容量瓶中，稀释至刻度。摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤液30mL，即为试液。试液中葡萄糖含量大于300问/mL时，应适当增加定容体积。2.5.2 含蛋白质的试样z用100mL烧杯称取试样(2.4)110 g(精确至0.0001 g) ，加少量重蒸饱水，转移到250mL容量瓶中，加入0.085mol/L亚铁氧化御溶液(2.2.3)5mL、O.25 mol/L硫酸绊溶液(2.2.4)5 mL和0.1mol/L氢氧化锅溶液(2.2.5)10mL.用重蒸馈水定容至刻度。摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤

9、液30mL.即为试液。试液中葡萄糖含量大于300吨/mL时，应适当增加定容体积e2.6 分析步骤2.6.1 标准曲线的绘制用微量移液管取0.00.0.20.0.40，0.60.0.80.1.00 mL葡萄糖标准溶液(2.2.6)，分别置于10mL 比色管中，各加入3mL酶试剂溶液(2.2.2)，摇匀，在36士1C水浴锅中恒温40min。冷却至室温.用重蒸馈水定容至10mL.摇匀。用1cm比色皿，以葡萄糖标准溶液含量为0.00的试剂溶液调整分光光度计的本点，在波长505nm处，测定各比色管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。2.6.2 试液吸光度的测定用微量移液管

10、取O.50 5. 00 mL试液(2.5)(依试液中葡萄糖的含量而定).置于10mL比色管中。以F按2.6. 1步骤操作，但须用等最试液(2.5)调整分光光度计的零点。329 GB!T 16285-1996 测出试液吸光度后，在标准曲线上查出对般的葡萄糖含量。2. 7 分析结果的发述样品中葡萄糖的含量以质量百分率表示，按式(1)计算2X1=一二亏XmX卡n Z X -n -AV -1 -x n AU U习ZAC . ( 1 ) n nu nv nv 穹i 飞Fhx m 式中，X1一-样品中葡萄糖的含量，质量百分惑，% ; C一一标准曲线上查出的试液中葡萄糖俞量，严g;m一一试样的质量，gV1一

11、一试液的定容体积，mL;V，一一测定时吸取试浓的体积，mL。汁算结果精确至小数点后第二位。2.8 允许差同一样品的两次测定皇之差，不得超过两次满定平均筐的5.0%。3 酶电极法3.1 原理葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下催化D-葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成。葡萄糖醺-11-内酸和过氧化氢e过氧化氢与过氧化氢型电极接触产生电流。该电流傻与D-葡萄糖的浓度呈线饺比例，在自尊电极葡萄糖分析仪上直接!i示葡萄糖含量CeH1206+02E2cetfEOOe+E4202 3.2 试数i3. 2. 1 组合试剂愈霉，德萄糖氧化酶酶滕黯z含葡萄糖氧化酶(GOD)15U(活力单位h须在0-c左右保存，

12、有效期12个月。b. 复合试jliJ:含磷酸二氢僻、磷酸氯二锅、乙二胶四乙酸二二锵、氯化锅、苯甲酸锅、庆大霉素硫酸盐寻常激保存，有效期24个月eC. D葡萄糖标准溶液:浓度100.0mg!lOO mL，曹封保存，有效期12个月。3.2.2 缓冲溶液将s袋复合试剂(3.2.1b)溶解在1000mL蒸缩水中，摇匀。pH=7.2士0.1。3.3 仪器和设备实验室常级仪器及下列各项23. 3. 1 研钵或粉碎机。3. 3.2 分析筛。3.3.3 级织捣碎机。3. 3. 4 晦电极葡萄糖分析仪z直接读数式，测量范围。-100.0mg!100 mL(D-葡萄糖)I测量精皮士1.0 mg!lOO mL(D葡

13、萄糖).3. 3. 5 j附撞进样将=容量501.，精疲1L.330 3. 4 试样的制备3. 4. 1 固体样品GB/T 16285一1996粉末状样品2取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。颗粒状样品取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。新鲜水果、蔬菜等固体样品:取有代表性的可食部分至少200g，置于密闭的玻璃容器内3.4.2 糊状样品取fj代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。3. 4.3 固液体样品取有代表性的样品至少200日，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。3. 4. 4

14、 液体样品取有代表性的样品至少200mL，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。如样品中含有二氧化碳，须用三角瓶取200mL，摇至基本无气泡，安装冷凝管，置沸水浴中加热10min，取出冷却至室温。3. 5 试液的制备3. 5. 1 固体试样和固液体试样-般团体试样和国液体试样:称取试样(3.4)110日(使之定容后葡萄糖含量为12()0 mg/时.)于100mL烧杯内，精确至0.0001g，用蒸馆水移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，放置30mm (摇动23次)。用快速滤纸或脱脂棉过滤。奔去最初滤液，收集12mL滤液于带盖小试管中。水果、蔬菜试样:称取试祥(3.4)l10g于100mL烧杯内(

15、使之定容后葡萄糖含量为1200 mg/mLl，精确窒O.000 1 g。加入煮沸的蒸馆水3050mL和5mL缓冲溶液(3.2.幻，继续煮沸3.-5 min.冷却至室温后用研钵研细或用组织捣碎机捣碎。用蒸馆水移入100mL容量瓶中，稀粹至刻度，摇匀。用快速滤纸或脱脂棉过滤。弃去最初滤液，收集12mL滤液于带盖小试管中。食用葡萄糖试样称取试样(3.4)1 10 g于100mL烧杯内，精确至O.000 1 g。加入约50mL蒸馆水.溶解后煮沸2min。冷却后用蒸馆水移入1000 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。3.5.2 糊状和液体试样称取试样(3.4)110 g(使定容后葡萄糖含量为1200mg/

16、mL)于100mL烧杯内，精确歪。.000 1 g 0用蒸馆水移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。用快速滤纸或脱脂棉过滤(吉日溶液是透明状，可免除过滤)。弃去最初滤液，收集12mL滤液于带盖小试管中。3.6 分析步骤3.6.1 校正仪器从组合试剂盒中取出电极，将其表面清理干净，吸取缓冲溶液(3.2.2)滴在电极表面。用小慑子取一片酶膜圈，安装在电极表面，使酶膜圈中心和电极中心的白金完全贴紧，形成无气泡的薄层液体，然后将电极安装在反应池内。仪器开机后，缓冲溶液即自动进入反应池，并自行冲洗。当仪器出现进样指令后，用微量进样器准确吸取25L标准溶液(3.2.1c)，用滤纸擦净针尖外部，将标准溶

17、液注入进样口内。2040s后仪器自动显示标准溶液的指示值。再等3060s，仪器自行完成冲洗过程，即可重复注入标准溶液(3.2.1c)数次，直至仪器显示允许开始测定样品。当连续两次标准溶液显示值的相对误差小于2.0%时，即完成校正步骤。3. 6. 2 测定样品!目试液(3.5)冲洗微量进样器，至少两次。准确吸取25L试液(3.5)，用滤纸擦干针尖外部，注入进样112040s后读取显示值。3. 7 分析结果的表述作品中筒萄糖的含址以质量自分率表示，按式(2)计算:3 :-l1 G8/T 16285一1996R x V, X. = 1000 X m , X 100 = R X V, , -叶-一一一

18、X 100 =一一一_.n. . . .( 2 ) 画100，-1000 X m, 式中:X，-一样品中葡萄糖的含量，走黛百分率，%i R一一仪器测定值，mg/100mL , V，一试液的定容体积，血L.m，试样的质量，g。计算结果精确宠小数点后第1位63.8允许差同一样品的两次测定值之差z样品中葡萄糖含量小于1.0%时，不得超过两次测定平均值的5.0%I 辛辛品中葡萄糖含量大子草草等于1.0%肘，不得超过两次测定平均值的2.0% . 332 G8/T 16285-1996 附录A(标准的附录)葡萄氧化酶、过氧化物酶的技术要求、试验方法及判定规则A1 技术要求A 1.1 酶活力葡萄糖氧化酶酶活

19、力(U/mg):注20，过氧化物酶酶活力(U/mg):二注500A1. 2 干扰酶葡萄糖氧化酶、过氧化物酶中都不得含有纤维素酶、淀粉葡萄糖背酶、-果糖苦酶、半乳糖背酶和过氧化氢酶。A2 试验方法用移液管吸取0.50mL葡萄糖标准溶液(2.2.6)，置于10mL比色管中，加入100问可溶性淀粉CHGB 3095，分析纯)、100昭纤维二糖(生化试剂)、100用乳糖(HG3-1 000，分析纯)和100问煎糖(HG 3-1001，分析纯)，再加入3mL酶试剂溶液(2.2.2)。以下按2.6. 1步骤操作。测定吸光度后，在标准曲线(按2.6. 1)上查出对应的葡萄糖含量，按式(Al)计算葡萄糖的回收

20、率=式中:F葡萄糖的回收率，% ; C 葡萄糖的实测值，问。A3 判定规则F=一一立一X 100 0.5 X 200 . .( A1 ) 测得葡萄糖的回收率，如在95%105%范围内，则判定葡萄糖氧化酶和过氧化物酶符合要求。附录B(标准的附录)葡萄糖氧化酶酶臆圈性能判定方法81 酶朦活性的判定校正仪器时，注入25L标准溶液(3.2.1c)，仪器显示标准溶液的指示值后，按下酶膜响应键，则显示出酶膜活性相对值。如相对值大于10.0，则表示酶膜活性符合要求;相对值小于10.0时J扩更换新酶膜。82 酶靡线性的判定校正仪器操作步骤完成后，仪器显示酶膜线性检查指令。用微量进样器注入50L标准溶液(3.2. 1c)，如显示值大于184.0，表示酶膜线性良好;小于184.0时，应按下仪帮线性校正键，进行线性333 GB/T 16285-1996 校正，或更换新酶膜。B3酶膜抗干扰性的判定校正仪器操作步骤完成后，用微量进样器吸取25L新配制的1%亚铁氟化御溶液，注入反应池进样口。当仪器显示值为-2.0+6.0时，表示酶膜抗干扰符合要求，否则应更换新酶膜。1%亚铁氟化御溶液的配和tl:用100mL烧杯准确称取1.15 g亚铁氟化御几Fe(CN)， 3H20. GB 1273.分析纯.加入少量蒸馈水使之溶解，转移至100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。334