GB T 4789.10-2008 食品卫生微生物学检验.金黄色葡萄球菌检验.pdf

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1、ICS 07.100.30 C 53 中华人民共和国国家标准2008-11-21发布GB/T 4789.10-2008 代替GB/T4789. 10-2003 食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验Microbiological examination of food hygiene Detection of StaphylococcuS aureus 中华人民共和国卫生部世主中国国家标准化管理委员会侃W2009-03-01实施中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB/T 4789. 10 2008 争舍中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100

2、045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销骨开本880X 1230 1/16 印张1字数24千字2009年3月第一版2009年3月第一次印刷* 书号:155066 1-36102 定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 4789.10-2008 目IJ1=1 本标准对应于国际分析家学会(AOACINTERNA TIONAL) AOAC 987. 09(食品中金黄色葡萄球菌分离和计数MPN法)(1991年)( AOAC Official Method 987. 09 , S

3、taphylococcus aureus in foods most probable number method for isolation and enumeration)和国际标准化组织ISO6888-1: 1999(食品和动物饲料中血浆凝固酶阳性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌计数方法)( Micro biology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staph ylococci ，Sta户hylococcusaureaus a

4、nd other species-Part 1: Technique using Baird-Parker agar medi um)。本标准与AOACOfficial Method 987. 09、ISO6888-1: 1999的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T4789. 10一2003(食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验。本标准与GB/T4789. 10-2003相比主要修改如下:一一规范了样品制备过程;一一对原标准中血浆凝固酶部分进行了修改。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位:中国

5、疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参与起草单位z上海市疾病预防控制中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、江苏省疾病预防控制中心。本标准主要起草人:刘秀梅、陈敏、刘弘、刘中学、卢行安、袁宝君、田静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一-GB4789.10-1984、GB/T4789. 10-1994、GB/T4789. 10-2003 0 I GB/T 4789.10-2008 食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1 范围头吸及器液移量地瞅瞅盯配杆旦回司在UFd叽可喜主仨-非L 如中材mo葡刊法色uu方黄眼具，、验金MNL检中Jm的击队lo菌

6、样都川忖顷球毒设度YMh川萄中养刻ONm葡物音Lol色食及。mJ密黄和菌C们此风精注口史。)m或b括3lp叫411i1飞J的知班士士Um琦品类常巳归心量径四食各室ulYM容直EI盯肝料她叫b协缸。白帆她川忖刷刷毗蝴培水时叫器器吸锥培一时计敖温箱温平质荡茵茵茵身H耕牛叫陌除恒冰恒天均振元元元注Pnu1 12345678911 呵，内，呵，呵，nJ坷，n丘呵，nd呵，nt呵，3 培养基和试剂3.1 10%氯化纳膜酶陈大豆肉汤:见第A.1章。3.2 7.5%氯化纳肉汤:见第A.2章。3.3 血琼脂平板:见第A.3章。3.4 Baird-Parker琼脂平板:见第A.4章。3.5 脑心浸出液(BHl)

7、肉汤:见第A.5章。3.6 兔血浆z见第A.6章。3. 7 磷酸盐缓冲液:见第A.7章。3.8 营养琼脂斜面:见第A.8章。3.9 革兰氏染色液z见第A.9章。3.10 元菌生理盐水:称取8.5g氯化纳溶于1000 mL蒸馆水中，121oc高压灭菌15min。3. 11 1 mol/L氢氧化纳(NaOH):称取40g氢氧化纳(NaOH)溶于1000 mL蒸馆水中。3. 12 1 mol/L盐酸(HCl):37%浓盐酸90mL，加蒸馆水到1000 mL。4 检验程序检验程序见图101 GB/T 4789.10-2008 检样25 g (或25mL)样品+225mL稀释液，均质增菌7.5%氧化铀肉

8、汤或10%氯化铀膜酷陈大豆肉汤36 .C士1c 18 h24 h Baird-Parker平板，血平板血平板18h24 h 36 .C士1c Baird-Parker平板18h24 h或45h48 h BHI肉汤和营养琼脂斜面36 c士1.C 18 h,. 24 h 图1金黄色葡萄球菌检验程序5 操作步骤5. 1 样晶的稀释5. 1. 1 固体和半固体样品:称取25g样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的元菌均质杯内，8 000 r/min_ 10 000 r/min均质1min_ 2 min，或放入盛有225mL稀释液的元菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min,_, 2 min，制成1

9、: 10的样品匀液。5.1.2 液体样品:以元菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的元菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的元菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1: 10的样品匀液。5.2 增菌和分离培养5.2.1 增菌培养:吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL 7.5%氯化销肉汤或10%氯化纳膜酷陈大豆肉汤培养基内，36oc士1oc培养18h,_, 24 ho金黄色葡萄球菌在7.5%氯化纳肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化纳膜酷炼大豆肉汤内呈混浊生长。5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板360C士1oC培养18h,_, 24 h

10、o Baird-Parker平板36oC士1oC培养18h,_, 24 h或45h,_, 48 h。5.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm,_, 3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但元混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金GB/T 4789.10-2008 黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色

11、镜检及血浆凝固酶试验。5.2.4 形态:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，元芽胞，元英膜，直径约为o.5m，._， 1m。5.3 血浆凝固酶试验5.3.1 挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂斜面，36oc士1oc培养18h ,._, 24 ho 5.3.2 取新鲜配制兔血浆。.5mL，放入小试管中，再加入5.3.1BHI培养物0.2mL,._, O. 3 mL，振荡摇匀，置36oc士1oc温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果

12、。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。5.3.3 结果如可疑，挑取营养琼脂斜面的菌落到5mL BHI, 36 oc士1C培养18h ,._, 48 h，重复5.3.2。5.4 葡萄球菌肠毒素的检测可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。6 结果与报告6. 1 结果判定:符合5.2.3、5.2.4、血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。6.2 结果报告:在25g(或25mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。3 GB/T 4789.10-2008 A.1

13、10%氯化纳膜酷陈大豆肉汤A. 1. 1 成分膜酷豚(或膜蛋白陈)植物蛋白陈(或大豆蛋白豚)氯化纳磷酸氢二饵丙酣酸纳葡萄糖蒸馆水pH7.3士0.2A. 1.2 制法附录A(规范性附录)培养基和试剂17 g 3 g 100 g 2.5 g 10 g 2.5 g 1 000 mL 将上述成分混合，加热，轻轻搅拌并溶解，调节pH，分装，每瓶50mL, 121 oc高压灭菌15mino A.2 7.5%氯化铀肉汤A. 2.1 成分蛋白豚牛肉膏氯化纳蒸馆水pH7.4 A.2.2 制法10 g 5 g 75 g 1 000 mL 将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶50mL, 121 oc高压灭菌15

14、min。A.3 血琼脂平板A. 3.1 成分豆粉琼脂(pH7.4,., 7. 6) 脱纤维羊血(或兔血)A.3.2 制法100 mL 5 mL,., 10 mL 加热溶化琼脂，冷却至50OC，以元菌操作加入脱纤维羊血(或兔血)，摇匀，倾注平板。A. 4 Baird-Parker琼脂平板A.4.1 成分膜蛋白陈牛肉膏酵母膏丙酬酸纳甘氨酸4 10 g 5 g 1 g 10 g 12 g GB/T 4789.10-2008 氯化鲤(LiCl 6H2 0) 琼脂蒸馆水pH7.0士0.2A.4.2 增菌剂的配法5 g 20 g 950 mL 30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚硝酸饵溶液10mL

15、混合，保存于冰箱内。A.4.3 制法将各成分加到蒸馆水中，加热煮沸至完全溶解，调节pHo分装每瓶95mL, 121 oc高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50OC，每95mL加入预热至50oc的卵黄亚暗酸饵增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。A.5 脑心浸出液(BHI)肉汤A.5.1 成分膜蛋白质陈氯化纳磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 葡萄糖牛心浸出液pH7.4士0.2A.5.2 制法10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 500 mL 加热溶解，调节pH，分装16mmX160 mm试管，每管5mL，置121oC

16、, 15 min灭菌。A.6 兔血浆取拧棱酸纳3.8g，加蒸馆水100mL，溶解后过滤，装瓶，121oC高压灭菌15min。兔血浆制备:取3.8%拧棱酸纳溶液一份，加兔全血四份，混好静置(或以3000 r/min离心30min) , 使血液细胞下降，即可得血浆。A.7 磷酸盐缓冲液A. 7.1 成分磷酸二氢饵(KH2P04)蒸馆水pH7.2 A. 7. 2 制法34.0 g 500 mL 贮存液:称取34.0g的磷酸二氢饵溶于500mL蒸馆水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化纳溶液调节pH至7.2，用蒸馆水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。稀释液z取贮存液1.25 mL，用蒸馆水稀释至1

17、000 mL，分装于适宜容器中，121oC高压灭菌15 min。A.8 营养琼脂斜面A. 8.1 成分蛋白陈牛肉膏氯化纳10 g 3 g 5 g 5 GB/T 4789.10-2008 琼脂蒸馆水pH7. 2-7.4 A.8.2 制法15 g-20 g 1 000 mL 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馆水内，加入15%氢氧化纳溶液约2mL，校正pH至7.2-7.40加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装13mmX130 mm管，121oc高压灭菌15mino A.9 革兰氏染色液A. 9.1 结晶紫染色液A. 9. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液A. 9. 1. 2 制法1. 0g

18、 20.0 mL 80.0 mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。A. 9. 2 革兰氏确液A. 9. 2.1 成分腆殃化饵蒸馆水A.9.2.2 制法1. 0g 2.0 g 300.0 mL 将腆与腆化饵先行混合，加入蒸馆水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL。A.9.3 沙黄复染液A. 9. 3.1 成分沙黄95%乙醇蒸馆水A. 9. 3.2 制法0.25 g 10.0 mL 90.0 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A.9.4 染色法A. 9. 4.1 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。A. 9. 4.2 滴加革兰氏腆液，作用1m

19、in，水洗。A.9.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s-30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.9. 4. 4 滴加复染液，复染1min，水洗、待于、镜检。6 B.1 设备和材料B. 1. 1 冰箱:0 oC -4 oC。B. 1.2 恒温或振荡培养箱:36oC :i: 1 c。B. 1.3 酶标仪。B. 1.4 离心机:8 000 r/min。B. 1.5 均质器或灭菌乳钵。B. 1.6 层析柱:40 mmX (20 mm-25 mm) 0 B. 1.7 微量加样器:200L、50L。B. 1.8 细滴管。B. 1.9 分液漏斗。B. 1. 10 透析袋。B. 1. 11 洗瓶。

20、B. 1. 12 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。B. 1. 13 灭菌培养皿:直径150mm。B. 1. 14 灭菌锥形瓶:250mL。B. 1. 15 有机玻璃模板。B. 1. 16 打孔器:直径2.5mmo B. 1. 17 载玻片、橡皮圈。B. 1. 18 灭菌玻璃纸、L棒、银子等。B.2 培养基和试剂B. 2.1 肠毒素产毒培养基zB. 2. 1. 1 成分蛋白陈膜消化酷蛋白氯化纳磷酸氢二饵磷酸二氢饵氯化钙硫酸续烟酸蒸馆水GB/T 4789.10-2008 附录B(规范性附录)葡萄球菌肠毒素检测方法20 g 0.2 g gbcbb phu-&TI

21、 0.1 g 0.2 g 0.01 g 1 000 mL 10 g-12 g(固体透析培养用)琼脂B. 2.1.2 制法除琼脂外将所有成分混于水中，溶解后调pH7.2-7. 4，如用固体透析培养法再加入琼脂，121oC高压灭菌30mino B.2.2 营养琼脂zB. 2. 2.1 成分蛋白豚10 g 7 GB/T 4789.10-2008 3 g 5 g 牛肉膏氯化销蒸馆水1 000 mL B.2.2.2 制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馆水内，加人15%氢氧化纳溶液约2mL，校正pH7.2 ,., 7. 4。加入琼脂，加热煮沸，121oc高压灭菌15min。B. 2. 3 1%琼脂糖溶液(0

22、.9%生理盐水配制)。B. 2. 4 0.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液。B.2.5 三氯甲烧。B. 2. 6 6 mol/L盐酸溶液。B. 2. 7 5 mol/L氢氧化锅。B.2.8 0.85%生理盐水。B. 2. 9 1%乙酸溶液。B. 2.10 0.1%唾嗦红R或氨基黑B。B. 2.11 硅胶或凡士林。B.2.12 A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。B.2.13 竣甲基纤维素(CM22或CM11Whatman)。B. 2. 14 0.2 mol/L pH6. 8磷酸盐缓冲液。B.2.15 酶标记A、B、C、D肠毒素抗血清或酶联免疫试剂盒。B. 2. 16 0.1 mol

23、/L pH9. 5碳酸盐缓冲液。B. 2.17 0.05%0.02 mol/L pH7. 2吐温-20缓冲液。B. 2.18 邻苯二胶酶底物。B. 2. 19 2 mol/L硫酸。B.3 检测程序B. 3.1 从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素，检测流程见图B.108 营养琼脂斜面36c士1C, 18 h24 h 用盐水洗下菌苔，放入产毒培养基固体培养法:36 c士1c培养48h 液体培养法:36 c士1c振荡培养48h8 000 r/min离Jr:20min，取上清液，加热100 c 10 min, 8 000 r/min离心10min，取上清液，浓缩双相琼脂扩散=微玻片法或玻片法检测葡萄

24、球菌肠毒素图B.1分离菌株培养物中葡萄球菌肠毒素的检测流程图GB/T 4789.10-2008 B. 3. 2 从食物样品中提取和检测葡萄球菌肠毒素B. 3. 2.1 微玻片法检测食品中葡萄球菌肠毒素(浓缩法和层析法)流程，见图B.2o固体检样100g加入o.2 mol/L pH1. 5磷酸盐缓冲液100mL, 4 c浸泡18h24h;液体检样直接吸取100mL液体检样z离心8000 r/min 20 min取上清液固体检样=离心8000 r/min 20 min取上清液加入三氯甲炕10mL15mL，振荡10min，静置，弃去三氯甲炕加入6mollL盐酸溶液调pH至4.5，8 000 r/mi

25、n, 20 min，取上清液加入5moVL氢氧化铀溶液，调pH至1.5，8 000 r/min , 20 min 取上清液，放入透析袋内，放多聚乙二醇或用电风扇吹干，浓缩到1mL2 rnL 用微玻片法检测葡萄球菌肠毒素用蒸馆水洗下浓缩物装入透析袋，以O.008 mollL pH5. 6磷酸盐缓冲液平衡浓缩法过CM层析柱流速1mLlmin2 mLlmin) 用O.008 mollL pH5. 6磷酸盐缓冲液约100mL洗脱用O.2 moVL pH6. 8磷酸盐缓冲液洗脱出葡萄球菌肠毒素用微玻片法检测葡萄球菌肠毒素层析法图B.2微玻片法检测葡萄球菌肠毒素(浓缩法和层析法)流程图9 GB/T 478

26、9.10-2008 B.3.2.2 酶联免疫法检测食品中葡萄球菌肠毒素的流程，见图B.3oB.4 操作步骤用o.1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液稀释血清，加入苯乙烯凹孔板o.2 mL, 36 c士1c 30 min 弃去上液，用0.05%0.02mol/L pH1. 2吐温-20缓冲液洗涤五次液体检样直接加入板孔0.2mL;固体检样100g十100mLO. 2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓神液，均质后取滤液0.2mL, 36 c士1c 30 min 弃去上液，用0.05%0.02mol/L pH7. 2吐温20缓冲液洗涤五次加入酶抗体0.2mL , 36 c士1c 30 min 弃

27、去上液，用0.05%0.02mol/LpH7. 2吐温-20缓冲液洗涤五次加入邻苯二胶酶底物0.2mL，置室温30min加入2moL硫酸0.05mL，立即比色图B.3酶联免疫法检测食品中葡萄球菌肠毒素的流程图B. 4.1 从分离菌株培养物中提取和检测葡萄球菌肠毒素的方法B. 4. 1. 1 液体透析培养法:将待测菌株接种营养琼脂斜面，37oc培养24h。用宽2.5cm、长80cm的透析袋装人60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析袋装人250mL锥形瓶内，加入15mL生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121oc高压灭菌30mino用5mL生理盐水洗下待测菌株菌苔，倾人上述培养瓶中，每个菌株

28、接种一瓶，37oc振荡培养48h，振速为100次/min。吸出菌液，8000 r/min离心20 min，加热100oC , 10 min，取上清液做双相琼脂扩散。如为阴性，装人透析袋内，用热风吹，或用多聚10 GB/T 4789.10-2008 乙二醇，浓缩至1mL2 mL后，做琼脂扩散实验。B. 4. 1. 2 固体透析培养法:待测菌株接种在营养琼脂平板，370C培养24h。向直径150mm的灭菌平皿中倾人灭菌产毒培养基约100mL,., 120 mL，凝固后表面铺一灭菌玻璃纸。用3mL生理盐水洗下待测菌株菌苔，倾注在玻璃纸上，用灭菌L棒涂匀平皿，37oC培养48h后，加入10mL,.,

29、20 mL灭菌生理盐水，用灭菌L棒刮取菌苔，吸取菌液离心。以下步骤同B.4. 1. 1。B.4.2 从食品中提取和检测葡萄球菌肠毒素的方法B. 4.2.1 直接浓缩法:取食品样品100g，加入元菌O.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4 oC浸泡18h ,., 24 h，用纱布过滤，将滤液离心8000 r/min 20 min。取上清液，放入分液漏斗中，加入10 mL三氯甲烧，振摇10min，静置，将底层三氯甲烧弃去(如不分层，可8000 r/min离心20min)。加入6mol/L盐酸溶液，调pH至4.5 , 8 000 r/min离心20mino取上清液，加5mol/

30、L氢氧化纳溶液，调pH至7.5，离心取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用热风吹，或用多聚乙二醇浓缩至1mL,., 2 mL，做微玻片双向琼脂扩散。B.4.2.2 层析法:如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馆水洗下，装人透析袋，以0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用O.2 mol/L pH6. 8磷酸盐缓冲液洗脱出葡萄球菌肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用热风吹或用多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻片双向琼脂扩散，检测葡萄球菌肠毒素。B.4.3 双向琼脂扩散检测葡萄球菌肠毒素的方法B. 4. 3.1 微玻片法:将在95%乙醇中浸泡的载玻片用洁净纱布擦干，吸取溶化的0.2%琼脂糖(蒸馆水

31、配制)滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放在无尘的环境中干燥。先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上。两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板上中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖。凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放入加有湿棉球的容器内，25 oC ,., 30 oC、18h,., 24 h观察结果。在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色(见图B.4)。A 被检样_ 对照葡萄球菌肠毒素 抗血清 被检样A一一被检样无肠毒素，为阴性; 被检样

32、B一一被检样3、5含肠毒素，为阳性;4元肠毒素，为阴性。B _-、.、/ 对照葡萄球菌肠毒素 被检样抗血清被检样 被检样圈B.4双向琼脂扩散检测葡萄球菌肠毒素的示意图B.4.3.2 玻片法;吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL，铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成辐射型，孔距为2.5mm，中心孔加入肠毒素抗血清，周围六个孔加入待测菌株或食品的肠毒素提取液，放人有滴加2/10000三氮化纳湿棉球的容器内，以保持湿度。置25oC ,-., 30 oC、18h ,-., 20 h观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。B.4.3.3染色法z用微玻片法取下胶带和有机玻璃模板，

33、玻片法可直接将玻片放入蒸馆水中浸泡4 h-8 h，中间换水2次，-.，3次，在下述各液中依次分别浸泡10min: 10%乙酸含1%唾嗦红R(或氨基黑); OON|OFgh寸同闰。GB/T 4789.10-2008 1%乙酸;1%乙酸含1%甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35 oc烘干。阳性者沉淀被染上颜色，可长期保存。B.4.4 酶联免疫法检测葡萄球菌肠毒素的方法(双抗体法)B. 4. 4.1 包被抗体:用O.1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5g/mL，加入洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2mL，置36oc士1oC 30 min，弃

34、去上液。B.4.4.2 洗涤:用0.05% O. 02 mol/L pH7. 2吐温-20缓冲液洗涤五次。B.4.4.3 加入检样:如为液体，可直接加入0.2mL;固体样品取100g，加入O.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液，均质后取滤液0.2mL。B.4.4.4 洗涤:同B.4.4.2。B.4.4.5 每孔加入酶抗体0.2mL，置36oC士1oC 30 min，同时做阳性和阴性对照，弃去上液。B.4.4.6 洗涤:同B.4.4.2。B.4.4.7 每孔加入邻苯二胶底物溶液0.2mL，室温放置30mino B.4.4.8 每孔加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶标仪比色。B.4.4.9 结果判定:样品OD值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。僵权必究书号:155066 1-36102 定价z16.00元骨版权专有GB/T 4789.10-2008