GB 4789.4-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验.沙门氏菌检验.pdf

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1、 中华人民共和国国家标准GB 4789.42010食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella 中华人民共和国卫生部发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 GB 4789.42010 I 前 言 本标准代替 GB/T 4789.4-2008食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验 。 本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下： 修改了标准的中英文名称； 修改了标准的范围； 修改了培养基和试剂； 修改了设备

2、和材料； 修改了附录 A。 本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为： GB 4789.4-84、 GB 4789.4-1994、 GB/T 4789.4-2003、 GB/T 4789.4-2008。 GB 4789.42010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌（ Salmonella）的检验方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱： 2 5 。 2.2 恒温培养箱： 36 1 ， 42 1 。 2.3 均质器

3、。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平：感量 0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶 :容量 500 mL， 250 mL。 2.7 无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.9 无菌试管： 3 mm50 mm、 10 mm75 mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（ BPW） ： 见附录 A 中 A.1。 3.2 四硫磺酸钠煌绿（ TTB）增菌液：见附录 A

4、中 A.2。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（ SC）增菌液：见附录 A 中 A.3。 3.4 亚硫酸铋（ BS）琼脂：见附录 A 中 A.4。 3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（ XLD）琼脂：见附录 A 中 A.6。 GB 4789.42010 2 3.7 沙门氏菌属显色培养基。 3.8 三糖铁（ TSI）琼脂：见附录 A 中 A.7。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。 3.10 尿素琼脂（ pH 7.2） ：见附录 A 中 A.9。 3.11 氰化钾 （ KCN） 培养基：见附录 A 中 A.10。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：

5、见附录 A 中 A.11。 3.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。 3.14 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ ONPG）培养基：见附录 A 中 A.13。 3.15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。 3.16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。 3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。 GB 4789.42010 3 4 检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1。 图 1 沙门氏菌检验程序 5 操作步骤 5.1 前增菌 称取 25 g（ mL）样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min 10 000 r/min 均质

6、1 min 2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min 2 min。若样品为液态， 不需要均质， 振荡混匀。 如需测定 pH 值， 用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.80.2。检样 36 1 ， 8 h 18 h TSI，赖氨酸， NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)， KCN 挑取可疑菌落 BS XLD（或 HE、显色培养基）1 mL+TTB 10 mL 1 mL+SC 10 mL 25 g（ mL）样品 +225 mLBPW H2S+ 靛基质 - 尿素 -KCN- 赖氨酸 + H2S+ 靛基质 + 尿素

7、 - KCN- 赖氨酸 + H2S-靛基质 -尿素 -KCN- 赖氨酸 +/- 反应结果与左侧描述不符 生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+ 42 1 ， 18 h 24 h 36 1 ， 18 h 24 h 36 1 ， 40 h 48 h 36 1 ， 18 h 24 h 甘露醇+、山梨醇+ ONPG- 报告非沙门氏菌 沙门氏菌，血清学试验 GB 4789.42010 4 无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 1 培养 8 h18h。 如为冷冻产品 ,应在 45 以下不超过 15 min,或 2 5 不超过 18 h 解冻。 5.2 增菌

8、 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 1 培养 18 h 24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 1 培养 18 h 24 h。 5.3 分离 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板） 。于 36 1 分别培养 18 h 24 h （ XLD 琼脂平板、 HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h 48 h （ BS 琼脂平板） ，观察各个平板上生长的菌落 ,各个平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属

9、在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 BS 琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD 琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿

10、刺；接种针不要灭菌 ,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 1 培养 18 h 24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 赖氨酸脱羧酶试验培养基 K A （） （） 可疑沙门氏菌属 K A （） （） 可疑沙门氏菌属 A A （） （） 可疑沙门氏菌属 A A / / 非沙门氏菌 K K / / / 非沙门氏菌 注： K：产碱， A：产酸；：阳性，：阴性；（） ：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性

11、。5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时 ,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验） 、尿素琼脂 （ pH7.2） 、氰化钾 （ KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 1 培养 18 h 24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 5 或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 GB 4789.42010 5 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢 （ H2S） 靛基质 pH 7.2 尿素 氰化钾 （ KCN）赖氨酸脱羧酶 A1 A2 A3 / 注：阳性；阴性；/阳性或阴性。 5

12、.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、 KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。 表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（ KCN） 赖氨酸 脱羧酶 判 定 结 果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌或（要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：表示阳性；表示阴性。 5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 5.4.2.3 反应序号 A3：补做

13、 ONPG。 ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性 ,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项 目 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN 注：表示阳性; 表示阴性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备 一般采用 1.2 1.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的

14、抗原。 O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 2 3） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰GB 4789.42010 6 上煮沸后再检查。 H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55 0.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3 0.4半固体琼脂的小玻管 1 次 2次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中

15、一个区域下部加 1 滴多价菌体（ O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定 同 5.5.2。 5.5.4 血清学分型（选做项目） 5.5.4.1 O 抗原的鉴定 用 A F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 被 A F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4； O3、 O10； O7； O8； O9； O2 和 O11 因子血清做凝集试验。根据

16、试验结果，判定 O 群。被 O3、 O10 血清凝集的菌株，再用 O10、 O15、 O34、 O19 单因子血清做凝集试验，判定 E1、 E2、 E3、 E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。 不被 A F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下： O多价 1 A， B， C， D， E， F，群 （并包括 6,14 群） O多价 2 13， 16， 17，

17、18， 21 群 O多价 3 28， 30， 35， 38， 39 群 O多价 4 40， 41， 42， 43 群 O多价 5 44， 45， 47， 48 群 O多价 6 50， 51， 52， 53 群 O多价 7 55， 56， 57， 58 群 O多价 8 59， 60， 61， 62 群 O多价 9 63， 65， 66， 67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定 属于 A F 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。 表 6 AF 群常见菌型 H 抗原表 O 群 第 1 相 第 2 相 A B B C1 C2 D（ 不产气的）

18、 D（产气的） E1 E4 E4 a g,f,s i,b,d k,v,r,c b,d,r d g,m,p,q h,v g,s,t i 无 无 2 5,Z15 2,5 无 无 6,w,x 无 GB 4789.42010 7 不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查，以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。 8 种多价 H 血清所包括的 H因子如下： H多价 1 a， b， c， d， i H多价 2 eh， enx， enz15， fg， gms， gpu， gp， gq， mt， gz51H多价 3 k，

19、r， y， z， z10， lv， lw， lz13， lz28， lz40H多价 4 1,2； 1,5； 1,6； 1,7； z6H多价 5 z4z23， z4z24， z4z32， z29， z35， z36， z38H多价 6 z39， z41， z42， z44H多价 7 z52， z53， z54， z55H多价 8 z56， z57， z60， z61， z62每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果， 没有 H 单因子血清的要用两个 H 复合因子血清进行核对。 检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1

20、相 H 抗原的 ,可在琼脂斜面上移种 1 2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。 位相变异试验方法如下： 小玻管法： 将半固体管（每管约 1 mL 2 mL） 在酒精灯上溶化并冷至 50 ，取已知相的 H因子血清 0.05 mL 0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过

21、高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清 1： 200 1： 800 的量加入。 小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内 ,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ，挑取因子血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种 1软琼脂斜面，于 37 培养后再做凝集试验。 简易平板法：将 0.35 0.4半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固

22、体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定 用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌 ,都柏林沙门氏菌。 5.5.4.4 菌型的判定 根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 A 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。 6 结果与报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（ mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。 GB 4789.42010 8 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1 成分 蛋白胨 10.

23、0 g氯化钠 5.0 g磷酸氢二钠（含 12 个结晶水） 9.0 g磷酸二氢钾 1.5 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.20.2 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ， 15 min。 A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 A.2.1 基础液 蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g氯化钠 3.0 g碳酸钙 45.0 g蒸馏水 1 00 mLpH 7.00.2 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH，高压灭菌 121 ，20 min。 A.2.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠（含 5 个

24、结晶水） 50.0 g蒸馏水 加至 100 mL高压灭菌 121 ， 20 min。 A.2.3 碘溶液 碘 片 20.0 g碘化钾 25. g蒸馏水 加至 100 mL将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 A.2.4 0.5煌绿水溶液 煌绿 0.5 g蒸馏水 100 mL溶解后，存放暗处，不少于 1d，使其自然灭菌。 A.2.5 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 gGB 4789.42010 9 蒸馏水 100 mL加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121 ， 20 min。 A.2.6 制法 基础液 90

25、0 mL硫代硫酸钠溶液 10 mL碘溶液 20.0 mL煌绿水溶液 2.0 mL牛胆盐溶液 50.0 mL临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。 A.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 A.3.1 成分 蛋白胨 5.0 g乳糖 4. g磷酸氢二钠 10.0 g亚硒酸氢钠 4.0 gL-胱氨酸 0.01 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.00.2 A.3.2 制法 除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液溶液 10 mL（称取 0.1 g L-胱氨酸

26、，加 1 mol/L 氢氧化钠溶液15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成，如为 DL-胱氨酸，用量应加倍） 。摇匀，调节 pH。 A.4 亚硫酸铋（BS）琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g葡萄糖 g硫酸亚铁 0.3 g磷酸氢二钠 4.0 g煌 绿 0.025 g 或 5.0g L 水溶液 5.0mL柠檬酸铋铵 2.0 g亚硫酸钠 6.0 g琼 脂 18.0 g 20 g蒸馏水 1 00 mLpH 7.50.2 A.4.2 制法 将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水（制作基础液） ，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中

27、，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，琼脂加入 600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至 50 55 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 GB 4789.42010 10 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h 会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.5 HE 琼脂 （ Hektoen Enteric

28、 Agar） A.5.1 成分 蛋白胨 12.0 g牛肉膏 3.0 g乳糖 12.0 g蔗糖 12. g水杨素 2 .0 g胆盐 20.0 g氯化钠 5.0 g琼脂 18.0 g 20.0 g蒸馏水 1 000 mL0.4溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mLAndrade 指示剂 20. mL甲液 20.0 mL乙液 20. mLpH 7.50.2 A.5.2 制法 将前面七种成分溶解于 400 mL 蒸馏水内作为基础液 ;将琼脂加入于 600 mL 蒸馏水内。 然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内 ,调节 pH。再加入指示剂 ,并与琼脂液合并 ,待冷至50 55 倾注平皿。 注

29、:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。 甲液的配制 硫代硫酸钠 34.0 g柠檬酸铁铵 4.0 g蒸馏水 100 mL乙液的配制 去氧胆酸钠 10.0 g蒸馏水 100 mL Andrade 指示剂 酸性复红 0.5 g1mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 mL蒸馏水 100 mL将复红溶解于蒸馏水中 ,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全 ,再加氢氧化钠溶液 1 mL 2 mL。 A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.6.1 成分 酵母膏 3.0 gL-赖氨酸 5.0 g木糖 3.75 g乳糖 7.5 gGB 4789.42010 11 蔗糖 7.

30、5 g去氧胆酸钠 2.5 g柠檬酸铁铵 0.8 g硫代硫酸钠 6.8 g氯化钠 5.0 g琼脂 15.0 g酚红 0.08 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.40.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外， 将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中， 煮沸溶解， 调节 pH。 另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 55 倾注平皿。 注 :本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.7 三糖铁（TSI）琼脂 A.7.1 成分 蛋白胨 20.0 g牛肉膏 5.0

31、g乳 糖 10. g蔗 糖 0 g葡萄糖 1.0 g硫酸亚铁铵 （含 6 个结晶水） 0.2 g酚 红 025 g或 5.0 g/L溶液 5.0 mL氯化钠 5.0 g硫代硫酸钠 0.2 g琼 脂 12.0 g蒸馏水 1 00 mLpH 7.40.2 A.7.2 制法 除酚红和琼脂外， 将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中， 煮沸溶解， 调节 pH。 另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约 2 mL 4 mL，高压灭菌121 10 min 或 115 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。 A.8 蛋白胨水、靛基质试

32、剂 A.8.1 蛋白胨水 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 mLpH 7.40.2 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH，分装小试管 ,121 高压灭菌 15 min。 A.8.2 靛基质试剂 GB 4789.42010 12 A.8.2.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇中 ,然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.8.2.2 欧 -波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。 A.8.3 试验方法 挑取小量培养物接种 ,在 36 1 培养 1 d 2 d，必要

33、时可培养 4 d 5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管 ,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧 -波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面 ,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注： 蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 A.9 尿素琼脂（pH 7.2） A.9.1 成分 蛋白胨 1.0 g氯化钠 5.0 g葡萄糖 1.0 g磷酸二氢钾 2.0 g0.4酚 红 3.0 mL琼 脂 20.0 g蒸馏水 1 00 mL20%尿素溶液 100 mLpH7.20.2 A.9.2 制法 除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮

34、沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装， 121 高压灭菌 15 min。冷至 50 55 ,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2。分装于无菌试管内，放成斜面备用。 A.9.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种 ,在 36 1 培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。 A.10 氰化钾 （KCN） 培养基 A.10.1 成分 蛋白胨 10.0 g氯化钠 5.0 g磷酸二氢钾 0.225 g磷酸氢二钠 5.64 g蒸馏水 1 000 mL0.5氰化钾 20. mLA.10.2 制法 将除氰化

35、钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 高压灭菌 15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5氰化钾溶液 2.0 mL（最后浓度为 1:10 000） ，分装于无菌试管内 ,每管约 4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧 ,放在 4 冰箱内 ,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基 ,分装试管备用。 A.10.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾（ KCN）培养基。并另GB 4789.42010 13 挑取 1 环接种于对照培养基。在 36 1 培养 1 d 2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性

36、（不抑制） ，经 2 d 细菌不生长为阴性（抑制） 。 注: 氰化钾是剧毒药 ,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严 ,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。 A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.11.1 成分 蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 3.0 g葡萄糖 1.0 g蒸馏水 1 000 mL1.6溴甲酚紫 -乙醇溶液 1.0 mLL-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mLpH 6.80.2 A.11.2 制法 除赖氨酸以外

37、的成分加热溶解后 ,分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。 L-赖氨酸按 0.5加入，DL-赖氨酸按 1加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡， 115 高压灭菌 10 min。 A.11.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 1 培养 18 h 24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。 A.12 糖发酵管 A.12.1 成分 牛肉膏 5.0 g蛋白胨 10.0 g氯化钠 3.0 g磷酸氢二钠（含 12 个结晶水） 2.0

38、g0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL蒸馏水 1 00 mLpH 7.40.2 A.12.2 制法 A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH。按 0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内， 121 高压灭菌 15 min。 A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后 ,分装每瓶 100 mL， 121 高压灭菌 15 min。另将各种糖类分别配好 10溶液，同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯 ,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 A.12.3 试验方法 :从琼脂斜面上挑取小量培养物接种

39、，于 36 1 培养 ,一般 2 d 3 d。迟缓反应需观察 14 d 30 d。 A.13 ONPG 培养基 GB 4789.42010 14 A.13.1 成分 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ ONPG） （ O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside）60.0 mg0.01mol/L 磷酸钠缓冲液（ pH7.5） 10.0 mL 1蛋白胨水（ pH7.5） 30.0 mL A.13.2 制法 将 ONPG 溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，用橡皮塞塞紧。 A.13.3 试验方法 自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于

40、36 1 培养 1 h 3 h 和 24 h 观察结果。如果 -半乳糖苷酶产生，则于 1 h 3 h 变黄色，如无此酶则 24 h 不变色。 A.14 半固体琼脂 A.14.1 成分 牛肉膏 0.3 g蛋白胨 1.0 g氯化钠 0.5 g琼脂 0.35g 0.4 g蒸馏水 100 mLpH 7.40.2 A.14.2 制法 按以上成分配好 ,煮沸溶解 ,调节 pH。分装小试管。 121 高压灭菌 15 min。直立凝固备用。 注 :供动力观察、菌种保存、 H 抗原位相变异试验等用。 A.15 丙二酸钠培养基 A.15.1 成分 酵母浸膏 1.0 g硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷

41、酸二氢钾 0.4 g氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL蒸馏水 1 00 mLpH 6.80.2 A.15.2 制法 除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH，再加入指示剂，分装试管， 121 高压灭菌 15 min。 A.15.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于 36 1 培养 48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。 GB 4789.42010 15 附录 B （规范性附录） 常见沙门氏菌抗原 B.1 常见沙门氏菌抗原 常见沙门氏菌抗原见表 B.1。 表 B.1 常见沙门氏菌抗原表 H抗原 菌 名 拉丁菌名 O 抗 原 第 1 相 第 2 相

42、 A 群 甲型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi A 1， 2， 12 a 1,5 B 群 基桑加尼沙门氏菌 S .kisangani 1,4,5,12 a 1,2 阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 S. arechavaleta 4,5,12 a 1,7 马流产沙门氏菌 S. abortusequi 4,12 - e,n,x, 乙型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi B 1,4,5,12 b 1,2 利密特沙门氏菌 S. limete 1,4,12,27 b 1,5 阿邦尼沙门氏菌 S. abony 1,4,5,12,27 b e,n,x 维也钠沙门氏菌 S. wien 1,4,12,27

43、b l,w 伯里沙门氏菌 S .bury 4,12,27 c z6 斯坦利沙门氏菌 S. stanley 1,4,5,12,27 d 1,2 圣保罗沙门氏菌 S. saintpaul 1,4,5,12 e,h 1,2 里定沙门氏菌 S .reading 1,4,5,12 e,h 1,5 彻斯特沙门氏菌 S. chester 1,4,5,12 e,h e,n,x 德尔卑沙门氏菌 S. derby 1,4,5,12 f,g 1,2 阿贡纳沙门氏菌 S. agona 1,4,5,12 f,g,s 1,2埃森沙门氏菌 S. essen 4,12 g,m - 加利福尼亚沙门氏菌 S. californi

44、a 4,12 g,m,t z67 金斯敦沙门氏菌 S. kingston 1,4,5,12,27 g,s,t 1,2 布达佩斯沙门氏菌 S. budapest 1,4,12,27 g,t - 鼠伤寒沙门氏菌 S. typhimurium 1,4,5,12 i 1,2 GB 4789.42010 16 拉古什沙门氏菌 S. Lagos 1,4,5,12 i 1,5 布雷登尼沙门氏菌 S.bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 基尔瓦沙门氏菌 S.kilwa 4,12 l,w e,n,x 海德尔堡沙门氏菌 S.heidelberg 1,4,15,12 r 1,2 印地安纳沙门氏菌 S

45、.indiana 1,4,12 z 1,7 斯坦利维尔沙门氏菌 S.stanleyville 1,4,5,12.27 z4,z231,2 伊图里沙门氏菌 S.ituri 1,4,12 z101,5 C1 群 奥斯陆沙门氏菌 S.oslo 6,7,14 a e,n,x 爱丁保沙门氏菌 S.edinburg 6,7, 14 b 1,5 布隆方丹沙门氏菌 S.bloemfontein 6,7 b e,n,x： z42丙型副伤寒沙门氏菌 S.paratyphi C 6,7,Vi c 1,5 猪霍乱沙门氏菌 S.choleraesuis 6,7 c 1,5 猪伤寒沙门氏菌 S.typhisuis 6,7 c 1,5 罗米他沙门氏菌 S.lomita 6,7 e,h 1,5 布伦登卢普沙门氏菌 S.br