DB32 T 3777-2020 规模化猪场猪圆环病毒病防控技术规范.pdf

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1、ICS 65.020.20 B 31 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3777 2020 规模化猪场猪圆环病毒病防控技术规范 Technical Specifications for Prevention and Control of Porcine Circovirus Diseases in the Large-scale Pig Farms 2020 - 04 - 08 发布 2020 - 05 - 15 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3777 2020 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1

2、4 诊断 . 1 5 疫情报告 与处置 . 4 6 预防与控制 . 4 附录 A（规范性附录） . 6 附录 B（规范性附录） . 10 DB32/T 3777 2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由南京 农业 大学提出 并 归口 。 本标准 起草单位：南京农业大学。 本标准起草人： 姜平、白娟、王先炜、李玉峰、陈闻、曹瑞兵、周斌、许家荣 。 DB32/T 3777 2020 1 规模化猪场猪圆环病毒病防控技术 规范 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒病的诊断、疫情报告、 疫情处置、预防与控制等技术规范。 本标准适用于规模化猪场猪圆环病毒病的诊断

3、、疫情报告和确认、疫情处置、预防与控制。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版 本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 21674 猪圆环病毒 聚合酶链式反应试验方法 GB/T 35910 猪圆环病毒 2 型阻断 ELISA 抗体检测方法 NY/T 541 兽医诊 断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫 技术 规范 DB32/T 1457 猪圆环病毒 2 型检测方法 SYBR Green I 实时定量 PCR 病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发

4、2017 25号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件。 3.1 猪圆环病毒病 Porcine circovirus disease, PCVD 又称猪圆环病毒相关性疾病，是由猪圆环病毒 2 型 （ PCV2） 感染引起的具有多种临床表现的疾病， 主要包括：断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍和肉 芽肿性肠炎。 3.2 猪圆环病毒 2 型感染 Porcine circovirus type 2 infection PCV2侵染猪体，并在一定部位定居、生长、繁殖，引起猪体一系列病理反应和免疫反应的过程， 包括亚临床感染和隐性感染。 4 诊断 4.

5、1 流行病学 4.1.1 PCV2 可以感染各种年龄、不同性别的猪，多呈亚临床感染。传 播途径有水平传播和垂直传 播。临床疾病多伴存在其他病原混合感染或继发感染。 DB32/T 3777 2020 2 4.1.2 断奶仔猪多系统衰竭综合征 一般发生于 5 周龄 12 周龄，发病率一般为 10%30%，有时高达 50%60%，死 淘 率在 5%20%范围内。 4.1.3 猪皮炎与肾病综合征主要发生于保育猪、育肥猪和成年猪，发病率通常低于 1%，饲养管理差 的猪场可以达到 10%或更高，高温季节发病率高。 4.1.4 猪呼吸道病综合征主要出现于 8 周龄 26 周龄猪群，发病率和死亡率随混合感染的

6、病原性质和 饲养管理条件差异较大。 4.1.5 母猪繁殖障碍主要见于后备母猪和第一和第二胎生产母猪。 4.1.6 肉芽肿性肠炎 主要发生于 8 周龄 16 周龄的猪。 4.2 临床症状 4.2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（ PMWS） 患猪主要表现皮肤苍白、被毛粗乱、呼吸困难、腹泻，呈现进行性消瘦，猪群长势不均，偶尔出现 黄疸症状，易继发其他病原感染，保育猪群死淘率约 10%20%。 4.2.2 猪皮炎与肾病综合征 （ PDNS） 患猪主要表现厌食和精神沉郁，后肢到会阴处皮肤或全身皮肤出现不规则、红色或紫色的斑疹或丘 疹，形成黑痂脱落，表皮损伤消退或留下疤痕，病程一般 7 d10 d。严重的

7、急性感染，可致死亡。 4.2.3 猪呼吸道疾病综合征 患猪主要表现生长缓慢、厌食、精神沉郁、发热、咳 嗽和呼吸困难 ,如与猪繁殖与呼吸综合征病毒 和猪肺炎支原体等病原混合感染，呼吸道症状表现会更加明显。 4.2.4 母猪繁殖障碍 本病主要见于后备母猪群和新侵猪群，主要 表现妊娠后期流产和木乃伊胎、死胎和弱仔数增多。木 乃伊胎可见于妊娠的各个阶段。 4.2.5 肉芽肿性肠炎 患猪主要表现皮肤苍白、生长缓慢、腹泻，粪便呈灰色，部分猪粪便带血。 4.3 病理变化 4.3.1 肉眼病变 4.3.1.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征： 消瘦、贫血、苍白，偶有黄疸。 肺脏肿大，间质增宽，呈间质 性肺炎变化，肺

8、质度坚硬或似橡皮。全身淋巴结肿大约 2 倍 5 倍，特别是腹股沟、纵膈、肺门和肠 系 膜淋巴结，切面为 苍白呈 灰黄色，混合感染时有出血。肾脏显著肿大，有白色坏死斑。脾脏肿大，部 分发病猪脾头出现折叠。 4.3.1.2 猪皮炎肾病综合征：以皮肤病变和肾脏白色坏死斑为主，皮炎主要见于猪的后肢和会阴部， 有时全身出现。 4.3.1.3 猪呼吸道病综合征：多有其它病原继发或混合感染，可出现相应疾病的病理变化，如胸膜 炎、心包炎、腹膜炎和关节炎等。 DB32/T 3777 2020 3 4.3.1.4 母猪繁殖障碍： 流产胎儿可能出现心肌肥大和肝脏充血。 4.3.1.5 肉芽肿性肠炎：肠黏膜增厚，肠系

9、膜淋巴结肿大，小肠壁剪开后自动外翻。 4.3.2 组织病变 不同 临床表现的猪圆环病毒病，患猪的组织学病变有一定共性，主要包括： 淋巴结：淋巴细胞减少，淋巴滤泡消失，出现多核巨噬细胞侵润及包涵体。 脾脏和扁桃体： B 细胞滤泡消失，出现包涵体。 肺脏：坏死性和溃疡性细支气管炎，肺泡隔膜的肉芽肿性炎症和细支气管周边的肉芽肿性增生和 混合性炎症。 4.4 实验室诊断 4.4.1 样品采集、保存与运输 4.4.1.1 基本要求 按照 NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范标准的要求进行。 4.4.1.2 组织样品采集与运送 采取发病猪或死亡猪的淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏组织样品， 于 2

10、 8条件下 24 h内送往实验室， 或置 -20冻存 ， 并在冻结状态下送往实验室。 同时，取患猪或病死猪的相同组织样品，用 4%甲醛溶液 固定，送往实验室。 4.4.1.3 血液样品 采集与运送 采用消毒注射器经患猪颈静 脉采集血液 2 mL，凝固后 24 h内 于 2 8条件下送到实验室。 4.4.2 病原学诊断 4.4.2.1 病毒分离与鉴定 按照 SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫技术规范进行。将待检样品无菌处理，接种 PK15 细胞，盲传 1 代 3 代，采用 聚合酶链式反应（ PCR）和间接 免疫荧光试验（ IFA）等方法进行鉴定。 4.4.2.2 间接免疫荧光试验（ IFA）

11、采用 PCV2 Cap 的单克隆抗体或 PCV2 阳性血清，检 测细胞培养物中的 PCV2 抗原（ 参见附录 A.1）。 4.4.2.3 聚合酶链式反应 采用针对 PCV2 基因的特异性引物，通过 PCR 方法或荧光定量 PCR 方法检测组织病料中的 PCV2 核酸。 按照 GB/T 21674 或 DB32/T 1457 方法进行。 4.4.2.4 免疫组化试验 肺脏、淋巴结或肠道组织经固定后，用 PCV2 特异性抗体检测组织中的病毒抗原 （参见附录 A.2） 。 4.4.3 血清学诊断 4.4.3.1 间接酶联免疫吸附试验（ ELISA） 抗体检测方法 采用商品化的 PCV2 间接 ELI

12、SA 抗体检测试剂盒进行检测。 DB32/T 3777 2020 4 4.4.3.2 阻断 ELISA 抗体检测方法 按照 GB/T 35910 猪圆环病毒 2 型阻断 ELISA 抗体检测方法 的 标准要求进行。 4.4.3.3 IFA 抗体检测方法 采用 PCV2 感染的 PK-15 细胞， 异硫氰酸荧光素（ FITC）标记的羊（鼠或兔亦可行）抗猪 IgG 或 FITC-SPA（ FITC 标记的葡萄球菌 A 蛋白） ，通过 IFA 抗体检测方法，检测 PCV2 抗体（ 参见附录 A.3）。 4.5 结果判定 4.5.1 同时 符合 4.1、 4.2 和 4.3 中对应疾病条件 ，判定疑似

13、猪圆环病毒病。 4.5.2 符合 4.5.1，并符合 4.4 .2 中的任何一条，确诊猪圆环病毒病。 4.5.3 符合 4.4.3 中的任何一条，判定 PCV2 感染（ 疫苗免疫猪群除外 )。 5 疫情报告与处置 按中华人民共和国动物防疫法和动物疫情报告管理办法中相关规定执行。发现疑似疫情， 畜主应对疑似患病动物进行隔离，对病猪污染的场所、用具、物品严格进行消毒。病死猪、淘汰猪 及废 弃物 按照 病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发 2017 25 号） 进行无害化处理。 6 预防与控制 6.1 免疫接种 目前，商品化的猪圆环病毒病疫苗有全病毒灭活苗和基因工程亚单位疫苗，可用于免疫母猪和仔

14、猪。 免疫程序一般为：母猪产前 45 d 左右首次免疫，间隔 3 周 4 周加强免疫。仔猪 2 周 3 周龄免疫，间隔 3 周 4 周可以再免疫一次。 6.2 饲养管理 完善日常饲养管理制度，严格实施全进全出和分群饲养制度，保持合适的饲养密度 。 尽量减少对猪 群的应激。注意环境清洁，改善空气质量，控制猪舍温度。改善饲料的质量， 提高猪群的营养水平。 保 育舍内设立独立的饮水加药设施。 产房、保育舍、配种怀孕舍、育肥舍和公猪舍应定期做好带猪消毒。生产区内，出入猪舍的各种器 具、推车和饲喂工具应每天刷洗干净，定期消毒。 母猪产前 1 周和产后 1 周 、 保育仔猪断奶后第 2 周和 第 4 周，

15、 饲料中可添加抗菌药物、免疫增强类药物或饲料添加剂等。 DB32/T 3777 2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 检测方 法 A.1 免疫荧光试验检测 PCV2 A.1.1 主要仪器 、 材料和试剂 荧光倒置显微镜、操净工作台、高速台式冷冻离心机和微量移液器（ 规格 0.5 L10 L、 20 L 200 L、 100 L1 000 L）。 96孔细胞板、 1.5 mL微量离心管和移液器配套的吸头等。 PK15细胞、 PCV2单克隆抗体、 PCV2病毒液和荧光标记二抗（ 羊抗鼠 -FITC、 SPA-FITC或抗猪 IgG-FITC）。 A.1.2 操作方法 A.1.2.1 细

16、胞制备 用含 10%小牛血清的 RMPI-1640营养液培养 PK15细胞，长满单层后，弃营养液， 用 Hanks液 洗涤单层 2次 3次后，用 0.025%胰酶消化，铺在 96孔板上， 37 5%CO2培养 36 h48 h，细 胞长满单层。 A.1.2.2 接种样品 将细胞培 养 物接种 96孔细胞单层板上， 50 L /孔， 37 吸附 1 h， 弃培养液， 加入 维持液（ 含 2%血清的 RMPI-1640营养液） ， 50 L /孔，同时 ， 设 PCV2病毒液 和 PBS缓冲液的接种，分别 作为阳性对照和 阴性对照， 37 5%CO2培养 36 h48 h。 弃培养液，每孔加入浓度

17、为 300 mmol/L的 D- 氨基葡萄糖 液 50 L ， 37 培养 30 min，弃去 D-氨基葡萄糖 液 换细胞维持液， 37 继续培养 24 h36 h。 A.1.2.3 固定 弃 维持 液，用 PBS缓冲液（参见附录 B.1）洗涤细胞一次，充分 晾 干后，加入 100 L 预冷的无水乙醇， 4 固定 45 min，用 PBS缓冲液洗涤 3次，每次 5 min。 A.1.2.4 加 PCV2抗体孵育 将抗 PCV2单 克隆抗体（或 PCV2阳性猪血清） 用 PBS缓冲液适当稀释后， 每孔加入 100 L ， 37 孵育 1 h。 A.1.2.5 漂洗 用 PBS洗涤 3次，每次 5

18、 min。 A.1.2.6 加 荧光二抗孵育 将荧光二抗如羊抗鼠 -FITC或 SPA-FITC，用 PBS缓冲液 1:100稀释后，每孔 加入 50 L ， 37孵育 1 h A.1.2.7 漂洗 同 A.1.2.5。 A.1.2.8 观察 于荧光显微镜下，观察细胞形态及有无绿色荧光的细胞。 A.1.3 结果判定 细胞形态规则， 且 PCV2阳性对照孔内细胞核内 含有大量 特异性绿色荧光， 而 阴性对照孔内无特异 绿色荧光时，则试验成立。样品孔细胞核内有荧光着染，则判 PCV2检测 阳性。 DB32/T 3777 2020 6 A.2 免疫组化法检测 PCV2 抗原 A.2.1 主要仪器、材

19、料和试剂 石蜡组织切片机、显微镜、微量移液器（ 规格 0.5 L10 L、 20 L200 L、 100 L1 000 L）。 病理组织染色缸、 载玻片、盖玻片 和移液器配套的吸头等 。 4%中性福尔马林、 4%多聚甲醛、 3% H2O2甲醇溶液、 1.5%的牛血清白蛋白、 二甲苯、 乙醇、石蜡、 PCV2 Cap单克隆抗体、 PCV2阳性对照血清和阴性对照血清、 HRP标记羊抗鼠 IgG（或 HRP标记羊抗猪 IgG）和 苏木精染色液等 。 A.2.2 操作方法 A.2.2.1 组织固定与修块 采集 待检 猪淋巴结、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、肠道、心脏等组织，大小 1 cm32 cm3，置 4

20、%缓冲 福尔马林中固定 8 h12 h后 ， 将组织修成 5 mm 5 mm 2 mm3 mm 的 小块，再置 4%多聚甲醛中固定 8 h12 h。 A.2.2.2 脱水、 透明 与 包埋 将固定好的组织取出，可稍作修整后，置于脱水筐中，用梯度酒精脱水。 75%乙醇浸泡 45 min1 h， 重复一次； 85%乙醇浸泡 45 min1 h， 重复一次； 95%乙醇浸泡 1 h2 h， 重复一次； 无水乙醇浸泡 1 h2 h，重复一次 。将脱水完全的组织浸泡于二甲苯中 3 min左右（肺脏透 明时间要控制好，不要超过 1 min），取出后，置于 60 石蜡中透蜡 2次，各 1 h1.5 h。透蜡

21、后，将组织 包埋于石蜡中。 A.2.2.3 载玻片及盖玻片的处理 将新的载玻片浸泡酸中过夜，用自来水充分冲洗后，去离子水清洗 干净， 并在温箱中烘干。如有必要，可用 0.1 mg/mL的多聚甲醛浸泡 10 min后烘干。 A.2.2.4 切片、贴片 与 烤片 将蜡块修整到比组织块略大，在切片机上 5 m厚度连续切片。将切好的 组织在 42 水浴中充分展平后，贴于载玻片上。贴片后平放一段时间，防止组织滑落，然后置于染色 架上 60 烤片过夜。处理好的组织切片可置于 2 8 保存。 A.2.2.5 脱蜡和水化 将组织片置于二甲苯中浸泡 10 min，更换二甲苯后 再 浸泡 10 min；无水乙醇中

22、 浸泡 5 min， 重复一次 ； 95%乙醇中浸泡 5 min， 重复一次 ； 85%乙醇中浸泡 5 min， 重复一 次 ； 75%乙 醇中浸泡 5 min， 重复一次 ； PBS清 洗 5 min，复洗 3次 。 A.2.2.6 抗原修复 在微波炉中将柠檬酸盐缓冲液 （附录 B） 加热至沸腾后，将组织切片置于缓冲液， 继续在微波炉中维持 15 min，取出后自然冷却至室温，然后用 PBS清洗 5 min，复洗 3次 。 A.2.2.7 封闭内源性过氧化物酶 将清洗好的组织切片擦干或自然干燥后，滴加 3% H2O2甲醇溶液 100 L ，于室温中孵育 15 min，以封闭内源性过氧化物酶，

23、防止非特异性染色。然后用 PBS清洗 3次，每次 5 min。 A.2.2.8 封闭 用浓度为 1.5%的牛血清白蛋白 (BSA)作为封 闭液，滴加在组织上，每块组织滴加 50 L ， 于室温封闭 15 min，用 PBS清洗 3次 ，每次 5 min。 A.2.2.9 加 PCV2抗体孵育 将 PCV2单克隆抗体 或 PCV2阳性猪血清 作 适当 稀释后，滴加在组织切片 上，每片组织滴加 100 L ，置于湿盒内， 37 孵育 1 h。孵育后，用 PBS清洗 5 min，重复 3次 。 A.2.2.10 加 二抗孵育 将 HRP标记羊抗鼠 IgG（或 HRP标记羊抗猪 IgG） 用 PBS作

24、 1:3 000稀释后，每组 织片滴加 100 L ， 37 孵育 1 h。用 PBS清洗 5 min，重复 3次 。 DB32/T 3777 2020 7 A.2.2.11 DAB显色 将组织片擦干，滴加 DAB显 色液 50 L ，于室温显色 5 min10 min（ 可在显微镜 下掌握染色程度 ） ， PBS清洗 5 min，重复 3次 。 A.2.2.12 苏木精复染、脱水、透明 和 封片 苏木精染色 1 min，水洗蓝化（在显微镜下掌握染色程度， 过度可用盐酸酒精分化）。梯度酒精脱水： 75%， 5 min， 2次； 85%， 5 min， 2次； 95%， 5 min， 2次； 1

25、00%， 5 min， 2次。二甲苯透明： 5 min10 min， 2次。取出 ， 待二甲苯 尚 未挥发完全时 ， 中性树胶封 片。 A.2.2.13 观察 将染色处理后的切片置显微镜下，观察组织细胞形态结构、淋巴细胞数量 ，尤其 是有 无细胞 着染 情况 。 A.2.3 结果判定 在高倍显微镜下观察， 切片组织中 出现棕黄色着染细胞 ， 判为 PCV2 抗原检出 阳性。 A.3 免疫荧光试验检测 PCV2 抗体 A.3.1 主要仪器 、 材料和试剂 荧光倒置显微镜、操净工作台、高速台式冷冻离心机和微量移液器（ 规格 0.5 L10 L、 20 L 200 L、 100 L1 000 L）。

26、 96孔细胞板、 1.5 mL微量离心管和移液器配套的吸头等。 PK15细胞、 PCV2病毒液、 PCV2阳性对照血清和阴性对照血清 、荧光标记二抗（ 羊抗鼠 -FITC、 SPA-FITC或抗猪 IgG-FITC） 。 A.3.2 操作方法 A.3.2.1 细胞制备 用含 10%小牛血清的 RMPI-1640营养液培养 PK15细胞，长满单层后，弃营养液， 用 Hanks液洗涤单层 2次 3次后，用 0.025%胰酶消化，铺在 96孔板上， 37 5%CO2培养 36 h48 h， 细胞长满单层。 A.3.2.2 接种 病毒 将 PCV2（ 104 TCID50/mL） 接种 96孔细胞单层

27、板上， 50 L/孔， 37 吸附 1 h，弃 培养液，加入 2%血清的 RMPI-1640维持液， 50 L/孔， 37 5%CO2培养 36 h48 h。弃培养液，每孔 加入浓度为 300 mmol/L的 D-氨基葡萄糖 液 50 L， 37 培养 30 min，弃去 D-氨基葡萄糖 液 换入细胞维 持液， 37 继续培养 24 h。 A.3.2.3 固定 弃 维持 液，用 PBS缓冲液洗涤细胞一次，充分干燥后，加入 100 L预冷的无水乙醇， 2 8 固定 45 min，用 PBS缓冲液洗涤 3次，每次 5 min。 A.3.2.4 加血清样品 孵育 取无菌处理的猪血清样品，用 PBS缓

28、冲液 做 2倍梯度稀释至 1:128，每个稀 释度样品加 2个孔， 每孔加入 100 L。同时，设 1:8稀释的 PCV2阳性对照血清和阴性对照血清，各加 2 个孔， 每孔加入 100 L， 37 孵育 1 h。 A.3.2.5 漂洗 用 PBS洗涤 3次，每次 5 min。 A.3.2.6 加 荧光二抗孵育 加入用 PBS缓冲液作 1:100稀释的荧光二抗 ，如 羊抗 猪 -FITC或 SPA-FITC， 每孔 50 L， 37 孵育 1 h。 DB32/T 3777 2020 8 A.3.2.7 漂洗 同 A.4.2.5。 A.3.2.8 观察 于荧光显微镜下，仔细观察细胞形态及有无绿色荧

29、光的细胞。 A.3.3 结果判定 细胞形态规则， 且 PCV2对照孔内 细胞核内含有大量特异性绿色荧光，阴性 血清 对照孔内无特异绿 色荧光时，则试验成立。样品孔细胞核内有荧光着染，则判 PCV2检测 为阳性。 以 荧光着染阳性 细胞孔 的最高血清稀释倍数作为血清抗体的检测效价。 DB32/T 3777 2020 9 B B 附 录 B （规范性附录） 试剂配制 B.1 PBS缓冲液 取 NaCl 8 g、 KH2PO42H2O 0.2 g、 Na2HPO42H2O 2.9 g和 KCl 0.2 g，溶于灭菌去离子水中，定容至 1 000 mL，分装； 100 mL/瓶。 2 8 保存 。 B

30、.2 抗原包被液 （ pH 9.6， 0.05 mol/L） 称取 Na2CO3 1.59 g、 NaHCO3 2.93 g， 加去离子水 800 mL， 用 1 mol/L的 NaOH调 pH值至 9.6， 加 去离子水定容至 1 000 mL。 B.3 封闭液 称取 BSA 1g，溶解于 100 mL PBST洗涤液中， 0.22 m滤膜过滤，分装后 4 保存。 B.4 血清样品稀释液 取 NaCl 8 g、 KH2PO42H2O 0.2 g、 Na2HPO42H2O 2.9 g、 KCl 0.2 g和 Tween-20 0.5 mL，溶于灭菌去 离子水中，定容至 1 000 mL， 0.

31、22 m滤膜过滤，分装； 20 mL/瓶。 2 8 保存。 B.5 PBST洗涤液 10 PBST洗涤液配制： 取 NaCl 80 g、 KH2PO42H2O 2 g、 Na2HPO412H2O 29 g、 KCl 2 g、 Tween-20 5 mL，加入灭菌去离子水充分溶解，定容至 1 000 mL， 0.22 m滤膜过滤，分装， 80 mL/瓶。 2 8 保 存。 洗涤液配制：将 10 倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解（或于 37 水浴锅中加热 5 min 10 min），然后用去离子水作 10 倍稀释，混匀，稀释好的洗涤液在 2 8 可以存放 7 d。 B.6 显色液 A液配制

32、：取 Na2HPO4 14.6 g、柠檬酸 9.33 g、 30%H2O2 2 mL，加 蒸馏水 至 1000 mL，调 pH至 5.2。 B液配制：取 3,3,5,5-四甲基联苯二胺（ TMB） 20 mg、无水乙醇 10 mL，加 蒸馏水 至 1000 mL。 使用前将 A液和 B液等量混合，分装于棕色瓶内， 20 mL/瓶， 2 8 避光保存。 B.7 终止液（ 2 mol/L H2SO4） 取去离子水 177.8 mL，缓慢加入 H2SO4 (96%) 22.2 mL， 10 mL/瓶， 2 8 保存 。 B.8 柠檬酸盐缓冲液 （ pH5.0， 0.01 mol/L） 0.1 mol

33、/L 柠檬酸： 取 21.01 g柠檬酸 ， 加 蒸馏水至 1000 mL。 0.1 mol/L 柠檬酸钠： 取 29.41 g柠檬酸 钠 ， 加 蒸馏水至 1000 mL。 DB32/T 3777 2020 10 取 9 mL 0.1 mol/L柠檬酸 和 41 mL 0.1 mol/L 柠檬酸钠， 用 1 mol/L的 NaOH调 pH值至 5.0， 加 蒸馏水 定容至 5000 mL，混匀， 100 mL/瓶， 2 8 保存 。 B.9 4%缓冲福尔马林 取 40%甲醛溶液 4 mL，加蒸馏水 定容至 100 mL，混匀， 2 8 保存 。 B.10 4%多聚甲醛 取 20 g多聚甲醛粉末，加蒸馏水 定容至 500 mL，混匀， 100 mL/瓶， 2 8 保存 。 B.11 3% H2O2甲醇溶液 取 1.5 mL H2O2， 加甲醇溶液 定容至 50 mL，混匀， 2 8 保存 。 B.12 1.5%的牛血清白蛋白 取 1.5 mL新生牛血清 ， 加 1 PBS缓冲液 定容至 100 mL，混匀， 2 8 保存 。 _