细胞培养.ppt

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1、细胞培养基础培训,小实验，大学问,培训日程安排,01,02,03,上午：9:30-11:30 理论学习,下午：13:0015:00 现场演示,下午：15:3016:30 练习操作,细胞培养相关设备,细胞培养技术,细胞培养主要试剂,细胞培养常见问题,细胞培养相关设备,配液,培养,灭菌,贮存,浸泡缸 去离子水 干燥箱 超声破碎仪 高压灭菌锅 移动紫外灯,超净工作台 生物安全柜 CO2钢瓶 倒置显微镜 台式离心机 CO2培养箱 血细胞计数板 移液器电动移液器,普通冰箱 超低温冰箱 液氮罐 干燥器 程序降温盒,0.22m滤膜、滤器 pH计 天平 磁力搅拌器 蠕动泵,4个功能区 准备区：清洗、消毒、准备

2、工作 制备区：培养基、试剂配制 贮存区：细胞库、物品存放 无菌区：更衣+缓冲+操作+培养,细胞培养相关设备,超净工作台/生物安全柜,二氧化碳培养箱,显微镜,液氮罐,离心机,超净工作台,细胞培养一般采用垂直流超净工作台紫外照射实现杀菌功能，紫外杀菌（表面）+臭氧杀菌（死角，挡板关闭）每次紫外照射20-30min后，鼓风10min后使用（注意培养室换风），洁净度达到百级紫外灯在3000 小时後功率会降至原来70%，及时更换 上方的粗滤布定期拆下清洗,正压状态，气体外泄，只保护操作对象，而不保护工作人员和实验室环境,生物安全柜,负压状态，气体不外泄，既保护样品，更侧重于保护操作人员和环境二级安全细胞

3、，携带病毒（如hele、KB）原代培养的临床人源样本慢病毒相关实验,在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器 移液器置于右前方易于取用的地方 试剂和培养基置于右后方，便于吸取 试管架置于中后部，用于固定其他试剂 细胞培养瓶置于左前部 75%酒精放于外部，用于消毒物品,安全柜内物品布局,中央区域才是严格的无菌区域，可进行无菌操作,离心机,细胞培养中的离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 -10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡,CO2培养箱,干式与湿式之分CO2培养箱设置条件为37，5% CO2温度： 37气相：95%空气和5%CO2，CO2 的作用：细胞生长需要、代谢产物、维持PH

4、，( CO2 ，PH?)水盘的水补充高温蒸发的水。水盘的水如何防止污染：无菌水+定期2周更换+防腐剂（0.02%叠氮钠或者2%硫酸铜）,显微镜-倒置,常见品牌：蔡司、莱卡、奥林巴斯、尼康 条件允许，可配置CCD摄像机,荧光系统 观察细胞形态、状态、污染,液氮罐,液氮的温度：液相，-196，气相-110 左右。有数据表明， -70，细胞每年死亡10%。通风、阴凉及时补充，液氮报警装置，液氮到中间位置时需补充。安全：护目镜+防护服,污染：冻存管存在泄漏的可能，细胞不能与菌种、组织样本共用一个液氮罐,细胞培养主要试剂,抗生素,胰酶,培养基,水/平衡盐,血清,添加物,细胞的培养的试剂,水,细胞培养用水

5、：超纯水、三蒸水、注射水贮存时间不能久，尽量少于外界接触。水中污染物：内毒素、无机离子（重金属，如铅、锌等），或有机复合物（单宁酸，杀虫剂等）,自来水中典型的杂质和细胞培养用水的目标值,平衡盐溶液,作用：洗涤细胞，作为配制其他试剂（胰酶）的基础液（渗透压、pH适应细胞）常用：PBS、Hanks、生理盐水,培养基,培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。,常见品牌：Gibco Hyclone,常见形式：市售干粉自己配制、过滤除菌（水，无菌器皿） 液体培养基注意有效期,有效期,干粉：2年，液体：10个月,培养基,所有的培养基都必

6、须在28，避光保存，不能冷冻，干粉培养基可在室温情况下运输。,常见种类：RPMI （Roswell Park Memorial Institute）1640 、DMEM（高糖）是最常用的DMEM or DME (Dulbeccos Modification of Eagles Medium)是Dulbecco改进的MEM. 氨基酸和维生素浓度是BME的4倍.最先葡萄糖的浓度是1g/L，称为低糖DMEM,后来增加到4.5g/L，称为高糖DMEM，广泛用于各种细胞培养。 RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute # 1640):是McCoys 5A 的改

7、进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4 度。,培养基,培养基,Gibco商品化的培养基,选择合适的RPMI-1640,RPMI-1640配方 31800系列是最基础的,培养基,不完全培养基：直接购买或者配制的培养基 完全培养基：不完全

8、培养基+血清+双抗+补充试剂,血清含有的维生素种类更齐全,血清,血清的主要成分,蛋白质：提供蛋白。与细胞培养相关功能 贴壁：层粘连蛋白(laminin,LN)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、胎球蛋白 胰酶抑制剂：如2-巨球蛋白，1抗胰蛋白酶 白蛋白：携带脂类、转运脂肪酸、结合类固醇和维生素进入细胞 转铁蛋白：转运铁离子 增加培养基的成泡性，减少吹打时的切力，缓冲pH，血清粘性，离心减少机械损伤生长因子与激素：细胞增殖与分化必须，如血小板生长因子、胰岛素 脂类、碳水化合物、尿素、无机物、维生素,血清成分复杂，大部分成分已为人知，但没有完全理解。 血清存在批次差异，供体的个体差异、

9、性别、年龄、生理条件、营养条件 血清存在病毒或者致病因子的风险 血清中含有易变物质，可能是“瓶中恶化”的原因之一。,血清的功能,生长、分化必须的物质： 生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质，小分子营养物；,转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等白蛋白,促进细胞贴壁、铺展,起酸碱度缓冲液作用,提供蛋白酶抑制剂,毒素灭火，蛋白质与有毒金属和热源物质结合,1,2,3,4,5,6,血清,FBS 胎牛血清,NBS 新生牛血清,CS 小牛血清,血清的分类,胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。,血清,八月龄胎牛心脏穿刺采血,10至14

10、天的小牛,1年以内的小牛,血清存在批次差异，多因素导致。每批次使用之前要验证大部分实验室没有做到。,血清如何使用,-20 保存，可保存3-5年 ，4 不要超过一个月，短期内无法用完一瓶，分装-20 保存。,保存,-20 4 室温 37 室温 ，过程不断摇晃，保持均一，可减少沉淀,完全培养基添加5-10%的血清，一般10%。有血清细胞可以增殖，无血清细胞不增殖但可生存,使用,56 水浴30min，灭活补体（补体具有酶活性的蛋白质，不耐热，介导溶菌、溶血、炎症）,灭活,验证,融解,血清,血清,血清使用常见问题,1 血清是否需要灭活？ 灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血

11、清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，网络上最常见的说法正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。研究补体系统时，有人建议ES细胞，平滑肌细胞时推荐使用。 个人建议，根据生产工艺和血来源，进口的胎牛血清不灭活，小牛、国产的胎牛灭活。2 为什么血清会出现沉淀？如何处理？ 沉淀产生原因：血清中的各种蛋白特别是脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。 如何处理：1 离心去除，不能过滤 2 吸取上层的血清使用，不吸到沉淀，最后的沉淀弃去3 添加了血清的培养基可长期保存吗？ 血清的某些成分在培养基中会降解，添加了血清的培养基建议1周内使用。4

12、 细胞因子、胆固醇诱导细胞的实验，细胞要先撤去血清饥饿,湿度,95%,温度,37 ，耐低不耐高，代谢与温度成正比,pH,耐酸不耐碱，7.2-7.4，干粉配时调制7.0-7.2，经过滤膜过滤会增加0.2,渗透压,人血浆渗透压，290mmol/L，医学上规定在280320范围内的为等渗,培养基一般略为低渗，如RMPI-1640为260-270,模 拟 的 理 化 环 境,模 拟 的 营 养 环 境,水蛋白质与氨基酸：生长因子与激素碳水化合物与单糖无机离子与微量元素,胰酶,胰酶：胰脏中分离，择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度 37,Ph 8.0，常用浓度0.1%-0.2

13、5%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养液终止胰酶对细胞的作用EDTA：化学螯合剂，螯合Ca2+、Mg2+，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），不能被血清中和，常用浓度为0.02%,小提示： 1、Ca2+ 、 Mg2+ 和血清降低胰酶的活性 2、血清中有胰蛋白酶抑制剂（如2-巨球蛋白），另外胰蛋白酶的效价有限，血清中的大量蛋白质也使胰酶消化能力消耗掉了 3、每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。 4、胰蛋白酶

14、对细胞的分离作用与细胞的类型关系密切，其他影响因素有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。 5、细胞贴壁与层粘连蛋白(laminin,LN)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)有关，而这些蛋白石钙依赖性蛋白，EDTA能与这些蛋白竞争性结合Ca2+、Mg2+ 6、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。1-2ml，1-5min内消化完成。,常用.2胰蛋白酶.,抗生素,1 、常用抗生素，青霉素加上链霉素，俗称“双抗”2 、初学者或者环境较差

15、者可使用抗生素，如条件允许，尽量不使用，是药三分毒抗生素危害：促进抗药性有机体生长，掩盖了隐蔽性、低水平的污染，一定程度掩盖轻度支原体污染3 、双抗一般配制成100X的贮存液，使用时添加至培养基中。将双抗配制好，最好滤菌后再分装到EP管中，保存到-20度以下的冰箱。用时取一支，若一支没用完，可以立即保存到-20度继续再用，但反复冻融的次数不宜过多。4、预防细菌污染，降低污染率，但是不能完全依赖双抗，培养细胞最关键的无菌技术,酚红 作用：指示剂 pH 7.4 红色，pH 7.0 橘红色，pH 6.5 黄色，低于pH 6.5 柠檬黄，高于pH 7.6 红色，桃红，高于pH 7.8 紫色,研究雌激素

16、特别是固醇类，酚红会有干扰。有些资料建议流式检测时酚红会干扰检测，实际上这种干扰时忽略不计的。,液体培养基放置较久，随着CO2挥发，pH逐步增高；细胞培养时，细胞消耗营养，不断产生代谢产物，产物偏酸， pH降低，可以间接判断培养基的营养成分的消耗（有数据表明95%的葡萄糖是通过糖酵解产生乳酸，降低了培养基的PH和增高了渗透压）,培养基常见添加物,培养基常见添加物,L-谷氨酰胺 1、谷氨酰胺在细胞培养中极其重要，培养基中谷氨酰胺的浓度远远高于其它氨基酸，谷氨酰胺的浓度一般是2-5mM,是其它氨基酸的10100倍，细胞培养中细胞进行能量生成以及蛋白质和核酸合成所必需的一种营养素，也是能量和碳源的主

17、要来源。 2、某些细胞的能量的主要来源，体外生长的细胞乳酸堆积，说明葡萄糖体外进行柠檬酸循环不能像在体内一样完全进行，谷氨酰胺与水在谷氨酰胺酶的作用下，分解成谷氨酸和氨。然后谷氨酸与丙酮酸在丙酮酸转氨酶的作用下，行成a-酮戊二酸和丙氨酸。然后就通过a-酮戊二酸进入三羧酸循环产生能量。细胞培养是不用谷氨酸而用谷氨酰胺是因为，谷氨酸带负电荷，不能通过细胞膜，所以要用中性的谷氨酰胺作为谷氨酸的前体加入。 3 、谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，谷氨酰胺可自发降解，生成的副产物是氨和焦谷氨酸，而氨对于一些细胞具有毒性（NH3改变pH） 。,培养基常见添加物,丙酮酸钠丙酮酸

18、钠可以作为细胞培养中的葡萄糖的替代碳源。NEAA非必须氨基酸，一般100X，最常用的是针对以MEN为基础的培养基，添加了7种氨基酸CaCl2对成骨细胞有毒性NaHCO培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，采用开放培养，在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，使细胞 代谢产生的CO2 及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2 浓度（5），与培养基中的NaHCO3 处于平衡状态。,细胞培养技术,细胞株的命名无统一规则,培养的细胞特性生长方式、形态,表型单一胚层起源性状均一,细胞培养技术,细胞生长方式与形态,多边形，呈铺路石样，尺寸规则

19、 来源于外胚层与内胚层 细胞紧密衔接，连接成片 如皮肤癌、消化道肿瘤、乳腺癌等,铺路石、上皮样细胞,培养的细胞特性生长方式、形态,培养的细胞特性生长方式、形态,细胞培养技术,细胞生长方式与形态,上皮样,起源于中胚层、具有细胞突起 呈梭形、不规则三角形、扇形 细胞不紧靠 如心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,梭形、成纤维样细胞,培养的细胞特性生长方式、形态,细胞培养技术,细胞生长方式与形态,成纤维样,悬浮生长，单个细胞或微小的细胞团，一般是血液系统、淋巴系统、巨噬细胞,淋巴母细胞样细胞、悬浮、球形,培养的细胞特性生长方式、形态,细胞培养技术,细胞生长方式与形态,细胞培养技术,细胞培养技术,清洗与灭

20、菌,玻璃器皿的清洗耗时繁重但基础重要 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。,防止破坏光洁度 不留死角,强氧化性 去除微量物质 过夜，至少6小时 绿色失效,冲洗10次以上，去除酸液后清洗液浸泡,冲洗10次以上，去除清洗液和离子,细胞培养技术,清洗与灭菌,01,02,03,04,05,干热灭菌,湿热灭菌,过滤灭菌,紫外照射,消毒液,细胞培养常用灭菌方法,干热：不常用，160 90-120min 慢 湿热：热稳定液体、玻璃、塑料、金属 121 ，30min留有空隙，盖子

21、不能紧（湿热空气穿透芽孢） 过滤：0.22m、不能去除支原体，一般用于不可高压的液 体如培养基、胰酶，还有试验用的药物，过滤时应 感觉到阻力，否则滤膜破 紫外：操作台面，实验室环境，留有死角 消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭、DMSO,酒精为什么用75%？ 配置的双抗还要灭菌吗？,细胞培养基本流程,细胞培养技术,细胞培养技术,复苏与冻存,1,2,3,长期保存细胞,防止细胞老化,减少人力、经费，减少污染,使细胞在水形成冰晶之前脱水,对细胞的机械损伤、PH改变、电解质变化等的影响,水变成冰晶，冰晶融化,加入保护剂,冻存时逐步脱水，复苏时，快速通过0度，防止冰晶形成,细胞冻存的意义,冻存和复苏最

22、主要的问题,细胞培养技术,冻存和复苏的原则：慢冻速融,营养,保护剂,低温,细胞保存的三要素,原则,慢冻速融,细胞培养技术,冻存液,常用的低温保护剂是DMSO，也有人说可以用甘油作用：渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。DMSO应使用细胞级（cell culture tested）或者以上的。保护剂的浓度在515%之间，各个细胞的DMSO浓度有区别的，常用10%。冻存液一般是10%DMSO+90%血清或者培养基（建议使用胎牛血清）不能现配现用，DMSO遇水产热 .,冻

23、存管,内旋、外旋螺旋盖 1.2ml、2ml、5ml 锥底、圆底 聚丙烯管身、硅胶螺旋盖,细胞培养技术,液氮,室温,以12 /min降温,100 ,25 ,以510 /min降温,可直接放入液氮,Click here to add your title,细胞冻存的温度控制要求,收集细胞,预先配制冻存液：血清：DMSO- 9 :1；取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml),分装,每管1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期,冻存,冷存管置于410分钟 -2030分钟 -801618小时(或隔夜)液氮槽长期储存。-20不可超过1小时，

24、以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，存活率稍微降低一些,细胞冻存方法,慢冻,细胞培养技术,1,从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）,2,5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上,3,低速离心10分钟,4,去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞,细胞复苏的方法,速融,快速融化，保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害 。,为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上细胞从液氮的-196 升到比如-80 这个过程对细胞没有损害，关键点是细胞尽

25、快通过冻存液的熔点0 。水浴可使用39 或者40 刚复苏的细胞异常脆弱，可以提前把培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和ph值都已经最适合细胞生长了。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。,可否不离心？,细胞培养技术,细胞传代,传代的意义：由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养细胞传代时机：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。,1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5 细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。

26、非细胞有丝分裂次数,细胞培养技术,基本步骤：,吸出培养瓶内旧培养液,加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）,吸出消化液，加入培养液终止消化,吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数,重新接种于新的培养瓶内,细胞培养技术,细胞培养技术,细胞培养常见问题,如何获得细胞？ 国家实验细胞资源共享平台 http:/ ATCC http:/www.atcc.org/ 凯基生物,如何选择培养基？ 指定、文献、数据库、尝试 如何尝试更换培养基？,如何选择细胞系？ 根据研究领域，种属、功能、原代/永生化细胞 权威性 发表文章应谨慎考虑国内建立的细胞株,购买、交换细胞株的注意事项 细胞运输方法： 液氮或

27、干冰贮存运输，需要特殊容器；充液法 收到细胞如何处理？如何转换为本实验室的培养条件？,细胞培养常见问题,培养细胞有危险吗？ 细胞及携带的微生物：皮肤或者黏膜接触、口腔接触、呼吸接触、血液接触，对于任何情况下的临床样本谨慎对待。,何为无菌技术？ 无菌工作区域 个人卫生 无菌试剂和培养 无菌操作,细胞培养常见问题,遇到细胞污染如何解决？,细胞污染：化学污染微生物污染交叉污染,细胞培养常见问题,如何选择培养瓶？ 培养瓶 T25、T75、T175、T225，瓶盖过滤、透气/密封，多聚赖氨酸、胶原蛋白余包被 培养板 6孔、12孔、24孔、96孔、384孔 培养皿 载玻片，腔室载玻片系统,细胞培养常见问题,如何细胞的质量控制？ 无污染：支原体，病毒 交叉污染/遗传性转稳定：同工酶、str、核型分析,细胞培养常见问题,谢谢！下午见！,