GB T 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方法.pdf
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1、ICS 65120B 46 囝目中华人民共和国国家标准GBT 21 1052007动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法Identification of Canis derived materials in animaloriginatedfeedstuffs-PCR method2007-1 0-24发布 2008-04-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局磐士中国国家标准化管理委员会及仲刖 吾GBT 21 1052007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中华人民共和
2、国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:高宏伟、梁成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟。本标准首次发布。动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法GBT 2”05电0071范围本标准规定了动物源性饲料中狗(Canis)源性成分检测的PCR方法,该检测方法的检出限为01。本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,
3、然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991 饲料 采样(GBT 1469912005,ISO 6497:2002,IDT)SNT 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31聚合酶链式反应 polymer嬲e chain reaction;PCR用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonucleosidea acid,脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条互不互补的寡核
4、苷酸片段即引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(de-oxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、退火和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经25个30个扩增循环,扩增倍数达到约106。4原理利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的NA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料51525354除另有规定外,试剂为分析纯或生化试
5、剂,实验用水符合GB 6682的要求。狗源性成分检测用引物(对)序列为:canis F:5一-TCCAGGTAAACCCTTCTT一3canis R:5-TACGAGCAALGGGTTGATGG-3TaqDNA聚合酶(Taq,Thermus aquaticu,水生栖热菌)。限制性内切酶:Hph I酶。dNTPs:dATP(deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidlne triphos-】GBT 21 1052007phate,脱氧胸苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dG
6、TP(deoxyguanosinetriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)。55琼脂糖:电泳纯。56溴化乙锭。57三氯甲烷。58异丙醇。59 70乙醇。510分子量标准品(100 hp2000 bp)(bp:base pair,碱基对)。511裂解液:1CTAB(cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),005 molL TrisHCI(pH 80)Tris:tris(hydroxymethyl)aminometbane,三(羟甲基)氨基甲烷,07 molL NaCl,001 molL EDTA(pH8o)(ethylene diaminetetraa
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