农业部1025号公告-8-2008 动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 酶联免疫吸附法.pdf

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1、ICS 67040X OO中华 人民共和 国国家标准农业部1025号公告一82008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测酶联免疫吸附法Determination of fluoroquinolones residues in animal ori西nated foodELISA method20080429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部1025号公告一8-2008本标准由中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人：沈建忠、丁双阳、何方洋、万宇平、张素霞、史为民、王战辉、冯才伟。本标准系首次发布的国家标准。1范围农业部

2、1 025号公告一82008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测酶联免疫吸附法本标准规定了动物性食品中氟喹诺酮类药物残留量检测的制样和酶联免疫吸附法。本标准适用于检测动物源性食品中猪肌肉、鸡肌肉、鸡肝脏、蜂蜜、鸡蛋和虾中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、唔喹酸、依诺沙星、培氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版

3、本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取鸡蛋去除壳后用均质器500 rrain匀浆20 S，使蛋清和蛋黄充分混合。取新鲜的蜂蜜样品备用。3 2样品的保存-20冰箱中贮存备用。4测定方法41方法原理或提要基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加标准品或待测样品，再加氟喹诺酮类药物单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加终

4、止液，在450 nm处测定吸光度值，根据吸光度值计算氟喹诺酮类药物的浓度。4 2试剂和材料4 21乙腈4 2 2正己烷423二氯甲烷4 2 4氢氧化钠4 2 5十二水合磷酸氢二钠4 26二水合磷酸二氢钠4 2 7氟喹诺酮类快速检测试剂盒1农业部1 025号公告一820082。C8冰箱中保存。4 271氟瞳诺酮类系列标准溶液0gL、1肛gL、3 pgL、9肛gL、27 pgL、81 pgL。4 2 7 2包被有氟喹诺酮类药物偶联抗原的96孔板12条8孔。42 7 3氟喹诺酮类药物抗体工作液4 274酶标记物工作液4 2 7 5底物液A液4 276底物液B液4 2 7 7终止液4278 2倍浓缩缓

5、冲液427 9 20倍浓缩洗涤液428缓冲液工作液用水将2倍浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液+1份水)，用于溶解干燥的残留物。4。C保存，有效期1个月。42 9洗涤工作液用水将20倍浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。4保存，有效期1个月。4 2 10 0 1toolL氢氧化钠溶液称取04 g氢氧化钠加水溶解稀释至100 mL。4211 乙腈0 1 toolL氢氧化钠溶液(84：16，vv)取乙腈84mL加到01toolL氢氧化钠溶液16mL中混合均匀。4 2 12乙腈0 1 toolL氢氧化钠溶液(50：10vv)取乙腈

6、50mL加到01molL氢氧化钠溶液10mL中混合均匀。4 213磷酸盐缓冲液(0 02 toolL，pH 7 2)取516 g十二水合磷酸氢二钠和087 g二水合磷酸二氢钠加水溶解稀释至1 L。4214磷酸盐缓冲液(0 05 molL。pH 7 2)称取129 g十二水磷酸氢二钠和218 g二水磷酸二氢钠加水溶解定容至1 L。43仪器和设备431酶标仪配备450 la_m滤光片。4 32氮气吹干装置433均质器4 3 4振荡器435涡旋仪436离心机43 7天平感量001 g。4 3 8微量移液器单道20 pL200 pL、100 pL1 000zL；多道250 pL。2农业部1025号公告

7、一8200844试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1鸡肌肉、鸡肝脏、猪肌肉、猪肝脏前处理过程称取3 g+003 g试样于50mL离心管中，加乙腈一o1toolL氢氧化钠溶液(84+16，vv)9mL，振荡混合10 rain，4 000 rrain离心10 min；移取上清液4 mL于50 mL离心管中，加002 molL磷酸盐缓冲液4mL，再加二氯甲烷8mL，振荡10rain，4 000 rrain离心10rain，取下层有机相6mL于10mL试管中，于

8、50水浴下氮气吹干；加缓冲液工作液05 mL，涡动2 rain溶解残留物，加正己烷1 mL，涡动2rain，4 000 rmin离心5 mira取下层清液50止分析。稀释倍数为08倍。452蜂蜜前处理过程称取1 g002 g试样于50mL离心管中，加005toolL磷酸盐缓冲液2mL，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；加二氯甲烷8 mL，振荡5 mln，4 000 rmin离心5 mira取下层有机相4 mL于10 mL玻璃试管中，于50。C下氮气吹干；用005toolL磷酸盐缓冲液1mL溶解干燥的残留物，取50 pL分析。稀释倍数为2倍。453鸡蛋前处理过程称取2 g土0029试样于15mL离心管

9、中，加乙腈8mL，振荡5mln，4 000 rrain离心5mlm取上清液2mL至10 rnL离心管中，50下氮气吹干；加正己烷1mL，涡动1rain加缓冲液工作液1mL，涡动2 min，4 000 rrain离心5 mln；取下层清液50止分析。稀释倍数为2倍。454虾、鱼前处理过程称取4 g土004 g试样于50mL离心管中，加乙腈一01molL氢氧化钠溶液12mL，震荡5min，4 000 rrain离心5 min取上清液6 mL，加002 toolL磷酸盐缓冲液6 mL，再加二氯甲烷7 mL，震荡5min。4 000 rmin离心5 min取下层有机相6 mL于10 mL离心管中，于5

10、0下氮气吹干；加002 toolL磷酸盐缓冲液05 mL，涡动2 min，加正己烷1 mL，涡动30 s，4 000 rmin离心5 rain；取下层清液50止分析。稀释倍数为05倍。455测定4551使用前将试剂盒在室温(19。C25。C)下放置1 h2 h。45 5 2按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行，计算所需酶标板条的数量，插入板架。4 5 5 3加系列标准溶液或试样液50 pL到对应的微孔中，加酶标记物工作液50 pL孔，再加喹诺酮类药物抗体工作液50“L孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温下避光反应60 rain。4 554倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除

11、去孔中的液体，加250止洗涤液工作液至每个孔中，5 S再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体。再加250”L洗涤液工作液，重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。4 5 5 5每孔加入底物液A液50止和底物液B液50止，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温下避光环境中反应30 min。4 5 56每孔加50“L终止液。轻轻振荡混匀，置酶标仪于450 nlTl处测量吸光度值。4 6结果计算与表达用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：D相对吸光度值()一芋100(1)上J 03农业部1025号公告一82008式中：B标准(试样)溶液的吸光度值Bo空

12、白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。将计算的相对发光度值()对应氟喹诺酮类药物标准品浓度(ggL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5交叉反应率表1交叉反应率药物名称 交叉反应率()环丙沙星 100o恩诺沙星 96 3诺氟沙星 1667氧氟沙星 125o洛美沙星 769嗯喹酸 1064依诺沙星 1053培氟沙星 1536达氟沙星 973氟甲喹 865麻保沙星 905氨氟沙星 110o双氟沙星 1o沙拉沙星 l o6检测方法灵敏度、准确度、精密度6 1灵敏度本方法在组织(猪肌肉肝脏、鸡肌肉肝脏、鱼、虾)样品中氟喹诺酮类药物的检测限3“gkg；在蜂蜜样品中氟喹诺酮类的检测限5 pgkg；鸡蛋样品中氟喹诺酮类的检测限2 pgkg。6 2准确度本方法在50 pgkg200 pgkg添加浓度水平上的回收率均为45125。6 3精密度本方法的批内变异系数45，批间变异系数45。