GB T 19567.3-2004 苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂.pdf

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1、ICS 65. 100. 10 G 25 11: .、GBjT 19567.3 2004 云忡办金芽Bacillus thuringgiensis weUable power , 2004心6-22发布2004-12-01实中华人民共和回国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布吧?GB/T 19567.3-2004 前苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis .B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴胞晶体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子量为130kDao生物测定中甜菜夜锁用于检测对鳞翅目贪夜峨

2、属害虫有特性的苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的毒力，小菜娥和棉铃虫用于检测对其他鳞翅目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的毒力.本标准是根据我国以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标准等有关材料，结合我国的实际情况制定的.本标准对苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据.本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位z农业部农药检定所、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心、湖北省生物农药工程研究中心.本标准主要起草人z姜辉、喻子牛、陈守文、王开梅、王晓军、吴新平、

3、顾宝根.本标准由农业部农药检定所负责解释.I GB/T 19567.3-2004 苏云金芽胞杆菌可湿性粉荆1 范围本标准规定了苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运.本标准适用于由防治鳞翅目害虫的苏云金芽胞杆菌原粉和助剂等制成的苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.GB/T 1250 极限数值的表示方法和判定方

4、法GB/T 1600-2001 农药水分测定方法GB/T 1601 农药pH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605一2001商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 5451-2001 农药可湿性粉剂湿润性测定方法GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3 要求3. 1 外观，灰白色或棕褐色疏松粉末，不可有团块.3.2 苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂应符合表l要求。表1苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂控制项目指标项日指标毒素蛋白030kDa)/ 32000 pH值6.0-7.5 水分I(%) 98 2.0 16000 注:P. x.、H.Q.和

5、S.e分别为小菜峨CPlutellaxylostella)、棉铃虫(Heliothisarmigera)和甜菜夜峨(Sodot. era exigua)缩写.1 GB/T 19567.3-2004 4 试验方法除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水榕液。4. 1 抽样按照GB/T1605一2001中团体制剂采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于1004.2 霉素蛋白含量用十二统基硫股纳聚丙烯股股(SOS-PAGE)凝胶图像处理法进行测定.4.2. 1 方法提要用碱性溶液处理苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂伴胞晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SOSPAGE.依蛋白质相

6、对分子质量的差异，使霉素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用电泳图像扫描蛋白区带回识，进行定量.4.2.2 仪器、设备a) 电泳仪gb) 垂直式电泳槽(1.5mm凹形带梢橡胶筷框).凝胶板面积170mmX170 mm( 1. 5 mm、20孔样品槽模具)I c) d) 电泳凝胶成像系统z离心机，10000 r/min; 的分析天平g精确至0.0001 g。4.2.3 试剂和溶液4.2.3.1 过硫阪饺(APS) 4.2.3.2 十二统基硫酸锦(SOS) 4.2.3.3 四甲基乙二胶CTEMEO).4. 2. 3. 4 氢氧化锅。4.2. 3. 5 30 %丙烯眈胶凝胶母液z称取丙烯酿胶30g.亚甲基双

7、丙烯眈胶原称g甲叉双丙烯眈胶)0.8 g.榕于100mL蒸惚水中，过滤，于4C暗处贮存备用.4.2.3.6 分离胶缓冲液z称取三经基甲基氨基甲烧(Tris)18.17g和SOS0.4 g溶于蒸馆水中，用浓盐酸泪至pH8.8.用蒸馆水定容至100mL. 4.2.3.7 浓缩胶缓冲液z称取Tris6. 06 g和SOS0.4 g溶于蒸饱水中，用浓盐酸调至pH6.8.用蒸惚水定容至100mL. 4.2.3.8 电极级冲液g称取Tris3.036 g.甘氨酸14.42g.SOS 1日，用水溶解并定容至1000 mL. 4.2. 3. 9 3 X样品稀释液，1mol/L , pH6. 8 Tris-HC

8、lI8. 75 mL.SOS 6 g.甘泊30mL.疏基乙薛15 mL.少许澳盼蓝，用蒸馆水定容至100mL. 4.2.3.10 固定液g量取95%乙醇500mL.冰乙酸160mL.用蒸饱水)容至1000 mL. 4.2.3.11 染色液s称取考马斯亮蓝(CBmR-250 1 g.加入95%乙院250mL.冰乙lIJ180 mL.蒸馆水定容至1000mL.辩解过滤后使用.4.2.3.12 脱色液g量取95%乙部250mL.冰乙酸80mL.用蒸饱水定容至1000mL. 4.2.3.13 毒素蛋白标样z毒素蛋白(相对分子量为130kOa)含量为8.0%的原粉.4.2.4 样品处理称取标样、试样各2

9、0.0mg(准确到O.1 mg) .移至1.5 mL离心管中，加1mL水充分悬浮.取100L加入另一1.5 mL离心管，加入0.5mol/L氢氧化钩溶液25L(使氢氧化纳溶液的终浓度为0.1 mol/L) .放置约5min，再加入3X样品稀释液75L.使最终体积为200L.于100C沸水中煮沸6 min，离心(2000 r/min) 10 min后取上层清液，以备电泳上样.2 GB/T 19567.3-2004 4.2.5 SDS-PAGE分寓毒素蛋白4.2.5.1 制备7.5%聚丙烯酷胶凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A(资料性附录) 4.2.5.2 上样取上述标样溶解液上层消液，于聚

10、丙始股胶凝胶的上样孔中分别上祥6，8、10、12、14L(毒素蛋白含量约为3g-7g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层消液(霉素蛋白含量约为5g)，加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源.4.2.5.3 电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到170V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积分数)乙酸中浸泡30min. 4.2.5.4 染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜.4.2.5.5 脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，37C保温脱色，更换几次脱色液，至背景清晰

11、为止.4.2.6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到分子量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析.样品中毒素蛋白的百分含量(x)按式(1)进行计算.XZLM100%叫1) C V 式中gM一一由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白量，样品的浓度，V一一样品的加样体织，n一一样品的稀释倍数.4.2.7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于5%.4.3 毒力效价的测定按附录B(规范性附录)进行。4.4 pH值的测定按GB/T1601测定.4.5 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定.4.6 水分的i!定按GB/T1600-2001中共沸蒸惚法进行

12、测定.4.7 悬浮率测定4.7. 1 仪器、试剂a) 量伺，250mL，具塞，b) 吸液管，c) 秒表，d) 三角瓶，500mL , 100 mL , e) 恒温水浴锅，1) 标准硬水z配制方法按GB/T5451中标准硬水配制方法进行.3 G/T 19567.3-2004 4.7.2 操作步骤称取可湿性粉剂样品200.0mg(精确到0.2mg)，于盛有玻璃珠的三角瓶中，加入标准硬水100 mL，用手左右振荡60次.制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量筒中，用标准.!水稀ff到250 mL. 将量筒放入30C士1C恒温水浴锅中，当悬浮液温度达到30C时，将量简盖好，拿起量筒先轻轻摇起沉淀物，然

13、后有规律地以量筒中部为中心上下颠倒305，佼呈均匀的悬浮液，量筒仍放入恒温水浴中，打开盖子，静置30min，用吸液管以抽气法将量仍上部9/10的悬浮液抽出(在155-30 s内完成拍液过程中，吸液管应依附筒壁随液面下降而下阵，勿搅动下部沉淀。按附录B(规范性附录)的方法，对可湿性粉剂及量简内剩下的25mL悬浮液进行毒力效价的测定.4.7.3 计算可湿性粉剂的悬浮率(y)按式(2)进行计算zI1 1. 1X(C-Q) , n/ Y=c 100% . . ( 2 ) 式中zC 供试可湿性粉剂的态力效价;Q一一留在最筒底部的25mL悬浮液的毒力效价。4.7.4 允许差两次重复测定结果之差应不超过10

14、%。4.8 湿润时间的测定按GB/T1600-2001中共沸蒸饱法进行测定.5 检验规则符合GB/T1604有关规定.极限值按GB/T1250处理.6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号及检测所用试虫.6.2 可湿性粉剂主要采用塑料袋包装，密封.6.3 贮存时严防日H目，勿受压，置于阴凉干燥处.6.4 运输时，注意轻放，防止损坏.6.5 保证期2在正常贮运条件下，可湿性粉剂质量保证期从生产日期算起为两年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含量不低于3.2指标.两年内产品毒力效价和毒素蛋白的含量不低于3.2指标的70%。4 A. 1 制板附录A资料性附

15、录)电泳凝胶的制备GBjT 19567.3-2004 本实验选用双垂直屯1梢，具体操作根据实验室条件而定。基本操作是根据;也泳档高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块端部带有2cm3 cm肉的凹梢。两块玻璃板洗净干燥后，在元凹惰的玻躏板两边各放一条问隙条(塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要而定)，然后放上带凹梢的玻璃板，用夹子将两块玻硝板固定，这样两块玻璃板之间就形成了一定的间隙.形成的间隙下端应该封闭，以防溶入的胶液漏出。一般用胶纸条封闭，待浓人的胶凝固后，再撕去胶纸;或用%1.5%浓度的琼脂封闭，方法是:在琼flt1巾加入电极缓冲IlX或茶馆水，在iJ水?自中加热溶解，将有?有

16、间隙的破碗饭装置垂直放在一个高3cm、宽3cm、比波璃板宽而长的一个小措内(商品也泳槽有配套装置)，趁热将济解的琼脂胶灌入小槽内，待拎却后取出，破硝板装置下:l:iJn纣严，可进行灌注聚丙烯股股胶液。A.2 制备分离胶从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按表A.配方配制分离胶。本试验巾分离胶浓度为7.5% 按表A.l配方将胶液配好、混匀后，迅速注入两块破羽的间隙中，至胶液!离破璃饭凹梢3cm左右.然后在胶因上轻轻铺cm高的蒸11W水.加蒸忧?水ntlJl常沿玻消极佼佼加入，勿扰乱胶而.垂直放置胶板于室温，h左右佼之凝聚此时在凝胶平1J!l 1水之间可以n到lHf晰的一条界面.然后fflH丰胶面上

17、的蒸切水。A.3 制备浓缩胶用盘根据实际情况而定，制各方法按表A.配方配制.按表A.配方将胶液混合，取少最灌入玻鸦板问隙巾，冲洗分两Itf胶面，而后倒出。将余下的胶液注人玻璃板间隙间，使胶液液固与玻璃板凹榕处平齐，而后插入梳子(样品相Hit极)，在室i111放置20 min30 min.浓缩胶即可凝聚.凝闵后，馒但取出梳子，取日J)Jv.防止把J!1孔弄破，取出梳子后在形成的胶孔中加入蒸惚水，冲洗未凝聚的丙烯眈胶吧，倒出孔中浆俯水，再加人也极flm液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳梢上，带凹梢的玻硝板与电泳柏紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，佼其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳梢

18、下梢的贮液捕中也加人电极绞冲液。表A.1 SDS-PAGE凝胶的配方贮存液分离胶浓缩胶30%丙烯眠股母液18 mI. 2 mL 分离肢缓冲液18 mI. 浓缩胶缓冲液4.5 mI. 双蒸水35 mL 11. 5 mL 10%过硫酸胶(APS)O. 5 mI. O. 1 mI. 四甲基乙二胶CTEMEDJ0.1 mL 0.02 mI. 5 GB/T 19567.3-2004 附录B(规范性附录毒力效价的测定B. 1 毒力效价的测定方法-一周小菜峨(Plutellaxylostella)作试虫的测定方法B. 1. 1 试剂或材料标准品:CS-1995.H3b.20000 IU/mg. 小菜峨幼虫:

19、Plutella xylostella. 食用菜籽泊-E手母粉=工业用.维生素C，医用，分析纯.琼脂s凝胶强度大于300g/cm. 磷酸氢二何z分析纯.磷酸二氢惆g分析纯.聚山梨醋-80，粘度3.5X 10 m/s-5.5X lQ-4 m/s. 菜叶粉g甘蓝型油菜叶.80C烘干，磨碎，过80目筛.i1f.糖s分析纯.纤维素粉CF-ll.氢氧化饵z分析纯.氯化锅s分析纯.15%尼泊金g对控基苯甲酸甲!ili(化学纯)溶于95%酒精.10%甲醒浓浓s甲应(分析纯)溶于蒸饱水.干防素溶液g干防素(BR生物试剂)2g.jm 0.001 mol/L氢氧化伺2mL.8 mL蒸馆水，灭菌.磷酸缓冲液g氯化纳

20、8.5g.磷股氢二何6.0g.磷酸二氢饵3.0g.聚山梨醋-80榕液0.1mL.蒸恼水1 000 mL. B. 1. 2 仪器、设备磨口三角瓶，250mL具塞.分析天平z精确到0.1mg. 电动搅拌器s无级调速.100r/min-6 000 r/min. 医用手术刀.振荡器.微波炉或电炉.水浴锅.养虫管，9cmX2.5cm.小烧杯，50mL. 大烧杯，500mL. 试管，18mmX 180 mm. 玻萌珠=直径5mmo 移液管，10mL.5 mL.2 mL.l mL. B. 1.3 测定步骤B. 1. 3. 1 感染浓的配制GB/T 19567.3-2004 B.l.3. 1. 1 标准品用分

21、析天平准确称取标准品100.0mg-150. 0 mg(精确到0.1mg).放人250mL装有10粒政璃珠的磨口三角瓶中。加人100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在振荡器上振荡3min，得到浓度为1 mg/mL的标准品母液(该母液在4C冰箱中可存放10天)。然后将标准品母液稀释成浓度为1.000、0.500、O.250、0.125、O.062 5、0.0313 mg/mL六个稀释感染液。B. 1. 3. 1. 2 可湿性粉剂样品称取相当于标准品毒力效价的样品适量(精确到0.2mg).加100mL磷R主缓冲液，然后参照标准品的配制方法配制样品感染液.对有些效价过高或过低的样品，在测定前需先以3

22、个距离相差较大的浓度做预备试验，估计致死中浓度(LC50值)的范围，据此设计稀释浓度。B. 1. 3. 2 感染饲料的配制饲料配方z维生素CO.5 g.于自3素溶液10mL.菜叶粉3.0日，酵母粉1.5 g.纤维素;)l.Og.琼脂粉2.0g.m;糖6.0g.菜籽泊0.2mL.I0%甲Iff溶液0.5mL，15%尼泊金1.0 mL.蒸馆水100mL。将煎糖、酵母粉、干II素溶液、掠脂粉加入90mL的蒸倒水中调匀。搅拌煮沸，使琼脂完全济化，加人尼泊金搅匀.将其他成分用剩余的10mLm恼水调成糊状。当琼脂玲tjJ至75C左右时与之充分混合，搅匀，置55C水浴锅中保温备用。取50mL烧杯7只，写好标

23、签，直55C水浴中预热，分别向每个烧杯中加人1mL对应浓度的感染液，以缓冲液作空白对照.向每个烧杯中加人9mL溶化的感染饲料，用电动搅拌器搅拌205，使每个统杯中的感染液与饲料充分混匀。将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1cmXl cm的饲料块.每个浓度取4个饲料块分别放入4支养虫管巾，每管放入一块，写好标签。B. 1. 3. 3 接虫感染随机取已放置饲料的养虫管。每管投入10头小菜织三龄初幼虫，每浓度4管，塞上棉寒，写好标签，在相同饲养条件下饲养.B. 1. 4 结果检查及计算感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫休，无任何反应者判为死亡.计算标准

24、品和样品各浓度的供试昆虫死亡率，查Abbott表或计算校正死亡率(X，)空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。校正死亡率按式B.1)计算z式中gT一一药剂处理死亡率;C一一空白对照死亡率。T-C XI=?一X100% ( B. 1 ) 将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用政小二乘法分别求出标准品LC50值和待测样品LC50值，计算待测样品的主主力效价(X2) 毒力效价按式(B.2)计算g式中ES一一标准品LC50值，P一一标准品效价$Y一一样品LC50值。X S P 2=一丁，.( B.2 ) 7 GB/T 19567.3-2004 B. 1. 5

25、允许差每力测定法允许相对俯差，但每个样品3次重复测定结果最大相对偏差不得超过20%。毒力测定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%-90%之间，在50%死亡率上下至少各有两个浓度.2 毒力效价测定方法一一以棉铃虫(He/iothisarmigera)作试虫的测定方法B. 2. 1 试剂和材料标准品:CS-1995.H3b.20000 IU/mg. 棉铃虫幼虫:1-1 eliothis armigera 0 黄豆粉z黄豆炒熟后磨碎过60日筛。大麦粉z过60日筛。酵母粉g工业用.36%乙酸溶液=乙酸(化学纯).溶于蒸饱水.苯甲酸销g分析纯。甲目l:分析纯.维生素C.医用，分析纯.琼脂粉z凝胶强度大于3

26、00g/cm. E洋自主缓冲液z问B.1.LB.2.2 仪器、设备分析天平:til确到0.1mg. 电动搅拌器z无级调速.100r/min-6 000 r/min. 微波炉或电炉。振荡器.水浴锅。组织培养盘:24孔。搪瓷盘:30cmX20 cm. 跻口三角瓶:250 mL. Jl1,l;. 大烧杯:1 000 mL. 小烧杯:50 mL. 试衍:18 mmX 180 mm。玻硝珠z直径5mma 注射器:50mL. 标本缸。恒温然养箱。B. 2. 3 iYm定步骤. 2. 3. 1 饲料准备饲料配方s酵母粉12g.黄豆粉24g.维生素C1. 5 g.苯甲酸钧。.42g.36%乙酸3.9mL.蒸惚

27、水300 mL. 将黄豆粉、陈母粉、维生素C、苯甲股纳和36%乙股放入大烧杯内，加100mL蒸馆水湿润备用.将余下200mL蒸馆水加入琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70C.与其他成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1mn，迅速移至60C水浴锅中加盖保温.B. 2. 3. 2 感染液的配制称100.0mg-150. 0 mg(精确到0.1mg)可湿性粉剂样品，至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液100mL.浸泡10min，在振荡器上振荡1min即成母液.于分析天平上称取150.0mg-8 G8/T 19567.3一2004300.0 mg标准品(精确到0.1mg)

28、.如上法制成母液。将样品和标准品母液用磷股缓冲液以一定的倍数等比稀楞，每个样品和标准品至少各稀ln个浓度，并设一级冲液作对照，每一浓度感染液吸取3mL 至50mL小烧杯内待用。对照吸取3mL磷酸缓冲液.8.2.3.3 饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注人上述已有样品或标准品感染液的烧怀内，以电动搅拌黯高速搅拌0.5 min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中倒人量不要求一致，以铺满孔底为准J.凝固f享用。B. 2. 3. 4 接虫感染于26C30C室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖人直径20cm的标本缸中，静待数分钟，选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们

29、移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫。每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立放于30C恒温培养箱内培养72h. B.2.4 结果检查和统计分析用肉眼或放大镜检查死、活虫数。以细签触动虫休，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡.可查Abbott校正值表或按式B.1)计算校正死亡率。对照死亡率在6%以下不用校正.6%-15%之间需校正.大于15%则试验无效.将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成几率缸，用最小二乘法分别求出标准品和样品的LC值，按式B.2)计算毒力效价。B.2.5 允许差毒力测定方法的允许相对偏差要求与B.

30、1. 5相同。B.3 毒力效价测定方法-一以甜菜夜峨(5podo ptera exigua )I试虫创测定方法B. 3. 1 材料和试剂标准品.C5-2002.H，.b.20000 IU/mg。甜菜夜峨幼虫:Spodopteraexigua 0 黄豆粉g黄豆炒熟后府碎过60日筛.酵母粉(200日).工业用。维生素C.医用，分析纯。15%尼泊金2对经基苯甲酸甲醋(化学纯)溶于95%洒糕。10%甲应g甲!IH分析纯)溶于蒸馆水。琼tl.凝胶强度大于300g/cm. 蒸惚水。B.3.2 仪器分析天平z精确度0.1mg。电动搅拌器2元级调速.100r/min-6 000 r/min. 微波炉或电炉。振

31、荡器。水浴锅.组织培养盘224孔。搪瓷盘.30cmX20 cm. 磨口三角瓶.250mL.具塞。大烧杯.1000 mL。小烧杯.50mL。试管.18mmX 180 mm. 玻璃珠z直径5mmo 9 GB/T 19567.3-2004 注射器，50mL. 标本缸。恒温培养箱。B. 3. 3 测定步骤B. 3. 3. 1 饲料配方黄豆粉32g(60日)，酵母粉16g(200日)，琼脂6g，维生素C2 g，15%尼泊金6.7mL，10%甲醒4 mL, 7.K 400 mL. 将黄豆粉、醉flJ:粉、维生素C、尼泊金和10%甲应放入大烧杯中，加入150mL水，混匀备用。将余下的250mL水加入琼脂，在

32、微波炉上加热至沸腾，使琼Bti完全洛化，取出冷却至70C。与其他成分混合.在电动搅拌器内高速搅拌1min，迅速移至60C水浴锅中加益保温.B.3.3.2 感染液的配制称取CS，.b-2002标准品150.0mg -300.0 mg(精确至O.1 mg)，置于250mL带有玻嘀珠的三角瓶中，加人100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在撞击涡振荡器上振荡1min后即为标准品感染母液.称取100.00mg -150.00 mg可湿性粉J1IJ样品，置于250mL带有玻鸦珠的三角瓶中，加入100mL磷酸级冲液，浸泡10min，在游涡振荡器上振荡1min配制成样品感染母液.以两倍稀释法将标准品和样品母液

33、稀释成一定浓度梯度，每个样品至少各稀释5个浓度梯度，每一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯中待用。对P.U吸取3mL磷政缓冲液。B.3.3.3 饲料和感染渡的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器搅拌0.5 min，迅速倒人组织培养盘上各小孔中(倒入量不要求一致，以铺满孔底为准)，凝固待用.B.3.3.4 接虫感染于26C-30C室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖人直径30cm的标本缸中，静待数分钟选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫.每个浓度和空臼对照皆放48头虫，用塑

34、料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖放于25C培养箱内培养72h. B. 3. 4 结果检查和统计分析用肉眼或放大镜检查死、活虫数，以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式(B.1)计算校正死亡率.对照死亡率在6%以下不用校正，6%-15%之间需校正，大于15%则试验无效。将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成几率值，用最小二乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品和样品的LC川按式。.2)计算毒力效价.B.3.5 允许差王军力测定方法的允许相对偏差要求与B.1. 5相同.B.4 对掺入其他有效成分的可疑样品的检测对于

35、某些符合正文3.2分析指标的可疑样品，可通过测定样品中胞品混合物的毒力贡献率，判定样品是否掺入其他有效成分。B. 4. 1 可湿性粉剂中不同成分的分离用丙阁将可湿性粉剂稀释成10mg/ mL的溶液，4c下5000 r/min离心10min，保留沉淀部分用等体积的丙酣悬泞，再进行离心，共离心洗涤3次，保留沉淀组分g用等体积的蒸倒水悬浮沉淀组分，离心并保留沉淀组分，共进行3次离心洗涤，保留沉淀组分，该沉淀组分即为可湿性粉剂中的胞品混合物.B.4.2 毒力效价的测定按B.1、B.2或B.3的方法，对单位质量可湿性粉剂及可湿性粉剂的沉淀组分(胞品混合物)分别进行毒力效价测定.10 GB/T 19567

36、.3-2004 B. 4. 3 样品中是否掺入其他有效成分的判断依据可湿性粉剂中胞品混合物的毒力贡献率(几来判断可湿性粉剂样品中是否掺入其他有效成分2毒力贡献率按式(B.3)计算sX, =手x100% 式中gI一一单位质量可湿性粉剂中胞品混合物的毒力效价，T一一单位质量可湿性粉剂的毒力效价.若可湿性粉剂中胞晶混合物的毒力贡献率小于70%，则判定此样品不符合标准。.( B.3 ) 寸OCNi1问-hcm户阳、筒。中华人民共和国国家标准苏云金芽胞杆菌可jl性粉剂GIlIT 19567.3-2001 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话，6852394668517548 中国标咱出版社泰且岛印刷厂印刷各地新华书店经的除开本880X12301/16 印张l字数22干字2004年11月第一版2004年11月第一次印刷 如有印装差错由本社发行中心调换G8fT 19567.3-2004