GB T 19567.1-2004 苏云金芽胞杆菌原粉.pdf

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1、I臼65.100.10G 25 共G/T 19567.1 2004 品4刃、 一玄金Bacillus thuringgiensis technical 2004-06-22发布/ 吧TP?中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2004-12-01实发布GB/T 19567.1-2004 前苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis .B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴胞晶体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子最为130kDa.生物测定中甜菜夜娥用于检测对鳞翅臼贪夜峨屑害虫有特性的苏云

2、金芽胞杆菌原粉的毒力，小菜娥和棉铃虫用于检测对苏云金芽胞忏菌鳞翅目害虫有活性的苏云金芽胞仔菌原粉的毒力.本标准是根据我国以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标准等有关材料，结合我国的实际情况制定的.本标准对苏云金芽胞籽茵原粉的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据。本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位g农业部农药检定所、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心、湖北省生物农药工程研究中心.本标准主要起草人z姜院、愉子牛、陈守文、王开梅、王晓军、吴新平、顾宝根。本标准由农业部农药

3、检定所负责解释.I GB/T 19567.1-2004 苏云金芽胞杆原粉1 范围本标准规定了苏云金芽胞杆菌原粉的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运.本标准适用于防治鳞翅曰害虫的苏云金芽胞杆菌原粉.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而.鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其是新版本适用于本标准。GB/T 1250 极限数值的表示方法和判定方法GB/T 1600-2001 农药水分测定方法GB/T 1601 农药pH(Ii的

4、测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605一2001商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3 要求3. 1 外观g灰白色或棕褐色粉末.3.2 苏云金芽胞抨茵原粉应符合表1要求.表1苏云金芽胞杆菌原粉控制项目指标指标项目B. t. a 一等品合格品一等品毒章蛋白(130kDa)/(%) / 、8.0 7. 0 7.0 毒力效价(P.H.a.)/(IU/mg) ;. 50000 毒力效价(5.t. )/(IU/mg) 、;.60000 50000 pH值5.5-7.0 水分/(%)6.0 细度(75m)/(%

5、);. 98 B. t. k 合格品6.0 40000 注1tP.:r.、H.Q.和S.e.分别为小菜峨(Plutellaxylostell川、棉铃虫(Heliothisarmigera)和甜菜夜蛇(5po.doptera exigua)缩写.注21B.t.a为苏云金芽胞轩菌钻浑亚种，B.t.k为苏云金芽胞杆菌库斯培克亚种.4 试验方法除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液.1 G/T 19567.1-2004 4. 1 抽样按照GB/T1605-2001中商品原药采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于1004.2 霉素蛋白含量用十二I:it基硫酸纳-聚丙

6、烯m:胶(S05-PAGE)凝胶图像处理法进行测定.4.2. 1 方法提要用碱性溶液处理苏云金芽胞忏菌原粉中的伴胞晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过S05-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与苏云金芽胞杆菌杂蛋白分离，之后用电泳图像扫捣蛋白区带面积，进行定量.4.2.2 仪器、设备a) 电泳仪，b) 双垂直式电泳槽(1.5 mm凹形带槽橡胶模框)，凝胶扳回积170mmX170 mm(l.5 mm、20孔样品槽模具); 0 电泳凝胶成像系统，d) 离心饥，10000r/min; e) 分析天平g精确至0.0001 g. 4.2.3 试剂和11I液4.2.3. 1 过硫酸饺(APS)

7、 4.2.3.2 十二烧基硫酸钧(SOS) 4.2.3.3 四甲基乙二胶(TEMEDJ.4.2.3.4 氢氧化锵.4.2. 3. 5 30 %丙烯院胶凝胶母液z称取丙烯酌胶30g，亚甲基双丙烯航胶(原称z甲叉双丙烯酷胶)0.8 g，溶于100mL蒸惚水中，过泼、，于4CBI处贮存备用.4.2.3.6 分离胶缓冲液s称取三资基甲基氨基甲烧(Tris)l8.17 g和SOSO. 4 g挥手于蒸馆水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸倒水定容至100mL. 4.2.3.7 浓缩胶缓冲液z称取Tris6. 06 g和SOSO. 4 g溶于蒸饱水中，用浓盐酸词至pH6.8，用蒸饱水定容至100mL。4.2.

8、3.8 电极缓冲液g称取Tris3.036 g，甘氨酸14.42g , SOS 1 g，用水溶解并定容至1000 mL. 4.2.3.9 3 X样品稀释液，1mol/L , pH6. 8 Tris-HCl 18. 75 mL, SOS 6 g，甘汹30mL，硫基乙碎15 mL，少许澳盼蓝，用蒸惚水定容至100mL. 4.2.3.10 固定液g量取95%乙醉500mL，冰乙酸160mL.用蒸饱水定容至1000mL。4.2.3. 11 染色浓z称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501 g，加入95%乙醉250mL，冰乙酸80mL，蒸恼水定容至1000 mL，溶解过滤后使用.4.2.3.12 脱色液z量

9、取95%乙醉250mL，冰乙酸80mL，用蒸惚水定容至1000mL. 4.2.3.13 毒素蛋白标样g毒素蛋白(相对分子量为130kOa)含量为8.0%的原粉.4.2.4 样品处理称取标样、试样各20.0mg(精确到O.1 mg) ，移至1.5 mL离心管中，加1mL水充分悬浮。取100L加入另一1.5 mL离心管，加入0.5mol/L氢氧化钩溶液25L(使氢氧化销溶液的终浓度为0.1 mol/L) ，放置约5min，再加入3X样品稀释液75L，使最终体积为200L，于100C沸水中煮沸6 min，离心(2000 r/min) 10 min后取上层消液，以备电泳上样.4.2.5 SD5-PAG

10、E分离毒素蛋白4.2.5.1 制备8-%-10%黯丙烯酿胶凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法参见附录A(资料性附录) 2 GB/T 19567.1一20044.2.5.2 上样取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酌胶凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14严L(毒素蛋白含量约为3p.g-7g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(霉素蛋白含量约为5g)，加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。4.2.5.3 电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到170V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积分数)乙酸中浸泡

11、30min. 4.2.5.4 染色将分离胶部分取下.用考马斯亮蓝(CBBlR-250染色液染色过夜.4.2.5.5脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，37C保温脱色，更换几次脱色液，至背景清晰为止.4.2.6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到分子量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析.样品中毒素蛋白的百分含量(x)按式。进行计算.x=半百XnX100%cx . ( 1 ) 式中zM一一由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白置，c 样品的浓度gV 样品的加样体积，n 样品的稀释倍数.4.2.7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平4.3 黯力效价的自1)定按附录B(规范

12、性附录进行.4.4 pH值的测定按GB/T1601测定4.5 细度的测定按GB/T16150一1995中2.2进行测定.4.6 水分的测定结果相对偏差小于等于5%.按GB/T1600-2001中共沸蒸馆法进行测定.5 位验规则需符合GB/T1604有关规定。极限值按GB/T1250处理.6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号及检测所用试虫.6.2 原粉主要采用塑料袋包装，密封。6.3 贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处.6.4 运输时，注意轻放，防止损坏。6.5 保证期s在正常贮运条件下，原粉质量保证期从生产日期算起为两年，产品出厂时毒力效

13、价和毒素蛋白的含量不低于3.2指标，两年内产品毒力效价和毒素蛋白的含量不低于3.2指标的70%.3 GB/T 19567.1-2004 A. 1 制极附录A资料性附录)电泳凝胶的制备本实验选用双垂直电泳槽，具体操作根据实验室条件而定。基本操作是根据电泳糟高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块端部带有2cm-3 cm高的凹槽.两块玻鸦板洗净干燥后，在无凹糟的玻璃板两边各放一条间隙条(塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要而定).然后放上带凹槽的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块菠璃板之间就形成了一定的间隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌入的胶液漏出.一般用胶纸条封闭，待灌入的胶凝固

14、后，再撕去胶纸，或用1%-1.5%浓度的琼nl封闭，方法是g在琼nl中加入电极缓冲液或蒸饱水，在沸水浴中加热溶解，将带有间隙的玻璃板装置垂直放在一个商3cm、宽3cm、比政璃板宽而长的一个小槽内(商品电泳槽有配套装置).趁热将溶解的琼脂胶灌入小糟内，待玲却后取出，玻璃板装置下端即封严，可进行灌注聚丙烯散胶胶浓.A.2 帘j备分离胶从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温.按表A.1配方配制分离胶。本试验中分离胶浓度为7.5% 按表A.1配方将胶液配好、混匀后，迅速注入两块玻璃的间隙中，至胶液面离玻璃板凹糟3cm左右.然后在胶面上轻轻铺1cm高的蒸惚水，加蒸馆水时通常沿玻漓板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放

15、置胶板于室温.1h左右使之凝聚.此时在凝胶和蒸馆水之间可以看到很清晰的一条界面.然后倒掉胶面上的蒸馆水.A.3 制备浓缩胶用量根据实际情况而定，制备方法按表A.1配方配制.按表人1配方将胶液混合，取少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离凝胶面，而后倒出.将余下的胶液注入攻璃板间隙间，使胶液液面与玻璃板凹梢处平齐，而后插入梳子(样品槽模板).在室温放置20 min-30 min，浓缩胶即可凝聚.凝固后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破，取出梳子后在形成的胶孔中加入蒸惚水，冲洗未凝聚的丙烯股胶等，倒出孔中蒸饱水，再加入电极缓冲液。将军E好胶的孩璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形

16、成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触.在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液.亵A.1 SDS-PAGE凝胶的配方贮存液分离胶浓缩胶30%丙烯股股母液18 mL 2 mL 分离肢缓冲液18 mL 浓缩胶缓冲液4.5 mL 双蒸水35 mL 11. 5 mL 10%过硫酸胶(APS)0.5 mL 0.1 mL 四甲基乙二胶(TEMED)。1mL 0.02 mL 4 附录B(规范性附豪)霉力效价的测定B. 1 毒力效价的测定方法-一用小菜娥(Plutellaxylostella)作试虫的测定方法B. 1. 1 试Ji!J;Jt材料标准品，C&1995.H3b.20000

17、IU/mg. 小菜娥幼虫，Plutellaxylostella 食用菜籽汹.酵母粉E工业用。维生素C，医用，分析纯.琼脂s凝胶强度大于300g/cm. 磷酸氢二斜，分析纯.磷酸二氢饵，分析纯.聚山梨1lll-80，粘度3.5X 10 m/s-5.5X10 m2/50 菜叶粉s甘蓝型油菜叶.80C烘干，磨碎，过80目筛.j1f.糖z分析纯.纤维素粉CF-ll 氢氧化何2分析纯.氯化纳g分析纯.15%尼泊金g对经基苯甲酸甲酣(化学纯)溶于95%酒精.10%甲应溶液g甲应分析纯)溶于蒸馆水.GB/T 19567.1-2004 于酷素溶液g干酷素(BR生物试剂)2g.加0.001mol/L氢氧化仰2m

18、L.8 mL蒸惚水，灭菌.磷自主缓冲液g氯化纳8.5 g.磷酸氢二绑6.0g.磷酸二氢何3.0g.聚山梨酶-80t在液0.1mL.蒸馆水1000 mL B. 1. 2 仪器、设备磨口三角瓶，250mL.具塞.分析天平z精确到0.1mg。电动搅拌器s无级调速.100r/min-6 000 r/min. 医用手术刀.微波炉或电炉。振荡器.水浴锅.养虫管，9cmX2.5 cm. 小烧杯，50mL. 大烧杯:500mL. 试管:18mmX180 mm. 玻璃珠g直径5mma 移液管:10 mL.5 mL.2 mL.1 mL. B. 1. 3 测定步骤B. 1. 3. 1 感染渡的配制5 GB/T 19

19、567.1-2004 B. 1. 3. 1. 1 标准晶用分析天平准确称取标准品100.0mg-150. 0 mg(精确到0.1mg).放入250mL装有10拉玻璃珠的磨口三角瓶中.加人100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在振荡器上振荡3min，得到浓度为1 mg/ mL的标准品母液(该母液在4C冰箱中可存放10天).然后将标准品母液稀释成浓度为1.000、0.500、0.250、O.125、0.0625、0.0313 mg/ mL六个稀释感染液.B. 1. 3. 1. 2 原粉样品称取相当于标准品毒力效价的样品适量(精确到0.2mg).加100mL磷酸缓冲液，然后参照标准品的配制方法配制样

20、品感染液.对有些效价过高或过低的样品，在测定前需先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计致死中浓度(LC四值的范围，据此设计稀释浓度。B. 1. 3. 2 感综饲料的配和l饲料配方g维生素CO.5g.干酷素溶液10mL.菜叶粉3.0g.酵母粉1.5 g.纤维素粉1.0 g.琼脂粉2.0 g.i.t.糖6.0g.菜籽汹0.2mL.10%甲醒溶液。.5mL.15%尼泊金1.0 mL.蒸馆水100mL。将藤椅、M母粉、干酣素榕液、琼脂粉加入90mL的蒸馆水中调匀.搅拌煮沸，使琼脂完全溶化，加入尼泊金搅匀.将苏云金芽胞抒菌成分用剩余的10mL蒸馆水调成糊状.当琼脂冷却至75c左右时与之充分混合，搅匀

21、，置55C水浴锅中保温备用.取50mL烧杯7只，写好标签，置55C水浴中预热，分别向每个烧杯中加入1mL对应浓度的感染液，以缓冲液作空白对照.向每个烧杯中加入9mL榕化的感染饲料，用电动搅拌器搅拌20s.使每个烧杯中的感染液与饲料充分混匀.将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1cmX1 cm的饲料块.每个浓度取4个饲料块分别放入4支养虫管中，每管放入一块，写好标签.B. 1.3.3 接虫感染随机取已放置饲料的养虫管.每管投入10头小菜峨三龄初幼虫，每浓度4管，裹上棉塞，写好标签，在相同饲养条件下饲养.B. 1. 4 结果位查及计算感染48h后检查试虫的死亡情况.判断死虫的标准是

22、以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡.计算标准品和样品各浓度的供试昆虫死亡率，查Abbott表或计算校正死亡率(X，)空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10% JilIJ试验结果无效.校正死亡率按式(B.1)计算2式中gT 药剂处理死亡率sC一一空白对照死亡率.T-C X, =一一X 100% . 1-C .( B.1 ) 将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法分别求出标准品LCso值和待测样品LCso值，计算待测样品的毒力效价(X，) 6 毒力效价按式(B.2)计算s式中25一一标准品LCso值，P 标准品效价，Y一一样品LCso值.( B.2) GB/

23、T 19567.1-2004 B.1.5.允许差毒力测定法允许相对偏差，但每个样品3次重复测定结果是大相对偏差不得超过20%。毒力测定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%-90%之间，在50%死亡率上下至少各有两个浓度.B.2 毒力效价测定方法一一以棉铃虫(IIeliothisarmigera)作试虫的测定方法B.2. 1 试剂和材料标准品:CS-1995.H，睛.20000IU/mgo 棉铃虫幼虫:Heliothis armigera 0 黄豆粉z黄豆炒熟后磨碎过60日筛。大麦粉.过60日筛。酵母粉s工业用。36%乙酸溶液s乙酸(化学纯).榕于蒸馆水.苯甲酸纳2分析纯.甲1Ii:分析纯.维生素

24、C:医用，分析纯。琼脂粉s凝胶强度大于300g/cm 0 磷酸缓冲液s同B.1.10B.2.2 仪器、设备分析天平s精确到0.1mg。电动搅拌器g无级调速.100r/min-6 000 r/mino 微波炉或电炉。振荡器。水浴锅。组织培养盘:24孔。搪瓷盘:30cmX20 cmo 磨口三角瓶:250mL.具塞.大烧杯:1000mLo 小烧杯:50mL。试lf:18 mmX 180 mmo 玻瑞珠z直径5mm。注射器:50mLo 标本缸.恒温培养箱.B. 2. 3 测定步骤B. 2. 3. 1 饲料准备饲料配方2酵母粉12g.黄豆粉24日维生素C1. 5 g.苯甲殴例。.42g.36%乙酸3.9

25、mL.蒸馆水300 mLo 将黄豆粉、M母粉、维生素C、苯甲酸伪和36%乙酸放入大饺杯内，加100mL蒸馆水湿润备用.将余下200mL蒸饱水加入琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70C.与苏云金芽胞忏菌成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌lmin，迅速移至60C水浴锅中加盖保温.B. 2. 3. 2 感染液的配制称100.0mg-150. 0 mg(精确到0.1mg)原粉样品，至盛有玻漓珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液100mL.浸泡10min，在振荡器上振荡1min即成母液.于分析天平上称取150.0mg-300. 0 mg 7 GB/T 19567.1-2004 标准

26、品(精确到O.1 mg).如上法制成母液.将样品和标准品母液用磷股缓冲液以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设一缓冲液作对照，每一浓度感染液吸取3mL至50mL 小烧杯内待用.对照吸取3mL磷酸缓冲液.B.2.3.3 饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器商速搅拌0.5 min，迅速IfiJ人组织培养盘上各小孔中倒入虽不要求一致，以铺满孔底为准入凝固待用。B. 2. 3. 4 接虫感染于26C30C室温下，将未经取食的初孵幼虫孵化后12h内)抖人直径20cm的标本缸中，静待数分钟，选取爬上缸口的健康幼虫作供

27、试虫，用毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫.每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋细紧，竖立放于30C恒温培养箱内培养72儿B.2.4 结果检查和统计分析用肉GI!或放大镜检查死、活虫数.以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率.如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式(B.1)计算校正死亡率.对照死亡率在6%以下不用校正.6%15%之间需校正，大于15%则试验无效.将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成几率值，用li1小二乘法分别求出标准品和样品的LC50值，按式(B.2)计算毒力效价.B.2.5 允许差毒

28、力测定方法的允许相对偏差要求与B.1. 5相同.B.3 毒力效价测定方法一一以甜莱夜峨(Spodopteraexgua)作试虫的测定方法B. 3. 1 材料和试剂标准品:C5-2002.H，.b.20000 IU/mg. 甜菜夜蛤幼虫:Spodopteraexigua. 黄豆粉2黄豆炒熟后磨碎过60日筛.酵母粉(200日):工业用.维生素C:医用，分析纯.15%尼泊金g对资基苯甲股甲黯(化学纯)浓于95%酒精.10%甲M:甲应分析纯)溶于蒸馆水.琼脂g凝胶强度大于300g/cm2 蒸馆水。B. 3. 2 仪器B 分析天平2精确度0.1mg. 电动搅拌器2元级调速.100r/min6 000 r

29、/min. 微波炉或电炉.振荡器.水浴锅，组织培养盘$24孔.搪瓷盘:30cmX20 cm. 磨口三角瓶:250mL.具i.大烧杯:1 000 mL. 小烧杯:50mL. 试管:18mmX180 mm. 玻璃珠z直径5mmo 注射器:50mL. 标本缸.恒温培养箱.B. 3. 3 测定步骤B. 3. 3. 1 饲料配方GB/T 19567.1-2004 黄豆粉32g(60日).酵母粉16g(200目).琼脂6g.维生素C2 g.15%尼泊金6.7mL.I0%甲应4 mL.水400mL. 将黄豆粉、酵母粉、维生素C、尼泊金和10%甲应放入大烧杯中，加人150mL水，混匀备用.将余下的250mL水

30、加入琼脂，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70C。与苏云金.w胞杆菌成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1min.迅速移至60C水浴锅中加盖保温.B.3.3.2 感染渡的配制称取CS中加人10omL磷殷缓冲液.浸泡10min，在游1月振荡器上振荡1rnin后即为标准品感染母液。称取100.0 mg-150.0 mg原粉样品，置于250mL带有玻璃珠的三角瓶中，加入100mL磷酸级冲液，浸泡10 min，在波涡振荡器上振荡1min配制成样品感染母液.以两倍稀释法将标准品和样品母液稀释成一定浓度梯度，每个样品至少各稀释5个浓度梯度，每一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯中待用.对照吸

31、取3mL磷酸缓冲液。B.3.3.3 饲料和感染渡的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染浓的烧杯内，以电动搅拌器搅拌0.5 min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中倒人景不要求一致，以铺满孔底为准).凝固待用.B.3.3.4 接虫感绿于26C-30C室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖人宜径30cm的标本缸中，静待数分钟，选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫.每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖放于25C培养箱内培养72h. B. 3.4 结果检查和

32、统计分析用肉眼或放大镜检查死、活虫数，以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率.如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式B.D计算校正死亡率.对照死亡率在6%以下不用校正.6%-15%之间需校正，大于15%则试验无效.将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成几率值，用最小二乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品和样品的LCsot按式(B.2)计算毒力效价.B. 3. 5 允许差毒力测定方法的允许相对偏差要求与B.1. 5相同.B.4 对掺入其他有效成分的可疑样品的检测对于某些符合正文3.2分析指标的可疑样品，可通过测定原粉样品中胞品混合物的毒力贡献率，判定样品中是否掺入其他有效

33、成分.B. 4. 1 原粉中不同成分的分离用丙罔将原粉稀释成10mg/ mL的溶液.4C下5000r/min离心10min，保留沉淀组分，用等休积的丙翻悬浮，再进行离心，共离心洗涤3次，保留沉淀组分，用等体积的蒸饱水悬浮沉淀组分，离心并保留沉淀组分，共进行3次离心洗涤，保留沉淀组分，该沉淀组分即为原粉中的胞品混合物。B.4.2 毒力效价的测定按B.l、日.2或B.3的方法，对单位质量原粉及原粉的沉淀组分(胞品混合物)分别进行毒力效价测定.9 GB/T 19567.1-2004 B. 4. 3 样品中是否掺入其他有效成分的判断10 依据原粉中胞品混合物的毒力贡献率(X3)来判断原粉样品中是否掺入

34、其他有效成分毒力贡献率按式(8.3)计算zX3=手Xl则. .( 8.3) 式中zI 单位质量原粉中胞晶混合物的毒力效价gT一一单位质量原粉的毒力效价.若原粉中胞品混合物的毒力贡献率小于70%.则判定此原粉样品不符合标准。、TOON-F -hc山由户H阁。中华人民共和国国家标准苏云金芽胞杆菌原粉GB/T 19567. 1-2004 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数20千字2004年11月第一版2004年11月第一次印刷 如有印装差错由本社发行中心调换GB/T 19567.1-2004