NY T 1847-2010 微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求.pdf

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1、ICS 65.080 B 10 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1847-2010 微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求General technical reqnirements for production strain quality of microbial fertilizer 2010-05-20发布200-09-0实施中华人民共和国农业部发布. 目。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。NY/T 1847-2010 本标准起草单位农业部微生物肥料和食用茵茵种质量监督检验测试中心、中国农业科学院农业资源与

2、农业区划研究所。本标准主要起草人t关大伟、陈慧君、李俊、沈德龙、姜听、杨小组:、曹凤明、冯瑞华、李力。I NY/T 1847-2010 微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求范围本标准规定了微生物肥料生产菌株的术语和定义、质量要求、试验方法和评价规则。本标准适用于微生物肥料生产中使用的菌株。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY 882 硅酸盐细菌菌种NY 1109 微生物肥料生物安全通用技术准则NY/T 1113-2006 微生物肥料术语NY 1117

3、水溶肥料钙、侯、硫含量的测定NY/T 1536-2007 微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南NY/T 1735 根瘤茵生产菌株质量评价技术规范3 术语和定义NY/T 1113-2006、NY/T1536-2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了NY/T11132006、NY/T1536-2007中的某些术语和定义。3. 1 微生物肥料microbial岛rtilizer含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。NY/T 1113一2006，定义2.1

4、J3.2 微生物肥料生产菌株strainfor microbial fertilizer production 从自然界分离筛选或经人工诱变，具备微生物肥料功能，并可用于生产的菌株。以下将其简称为菌株。3. 3 基质substrate 指不含目的微生物或目的微生物被灭活的物料。NY/T 15362007，定义3.7J 4 质量要求4. 1 基本要求菌株通过安全性评价，符合NY110日中的规定。菌株细胞、菌落形态致，元杂菌污染，生长繁殖力强;生长所需的碳源、氮源等原料易获得。菌株遗传性状稳定，其功能和发酵性能可长期保持，存活能力强。4.2 菌株功能要求1 NY/T 1847-2010 4.2.

5、1 提供或活化养分功能4. 2. 1. 1 溶解无机磷能力在含有难溶性无机磷培养液中，接种菌株与未接种相比，可溶性磷的含量增加70mg/L以上。4.2.1 2 分解有机磷能力在含有难溶性有机磷培养液中，接种菌株与未接种相比，可溶性磷的含量增加5mg/L以上。4.2. 1.3 固氮能力4.2. 1.3. 1 共生固氮菌具有共生固氮作用的菌株质量应符合NY/T1735的规定。4. 2. 1. 3. 2 自生固氮菌和联合国氮菌在盆栽试验中，接种菌株与未接种处理相比，植株总含氮量增加量达到t检验的显著水平。4. 2. 1. 4 解锦能力具有解何作用的菌株质量应符合NY882的规定。4 2. 1. 5

6、溶解中量元素能力在含有难溶性钙、簇或硫元素的培养液中，接种菌株与未接种相比，相应的可溶性元素增加量分别达到t检验的显著水平。4.2.2 产生促进作物生长活性物质能力在适宜培养条件下，菌株产生的具有促进作物生长功能的活性物质总量应在5mg/L以上。其中包括赤霉素、呵i味乙酸、细胞分裂素等。4.2.3 促进有机物料腐熟功能4.2.3. 1 产纤维素酶能力在适宜的培养条件下，菌株产生纤维素酶的活力在70u/mLCg)以上o4 2 3. 2 产木聚糖酶能力在适宜的培养条件下，菌株产生木聚糖酶的活力在7u/mLCg)以上。4.2.3.3 产蛋白酶能力在适宜的培养条件下，菌株产生蛋白酶的活力在100u/m

7、LCg)以上。4.2.4 提高作物晶质功能接种菌株与基质处理相比，提高作物品质效应差异达到统计检验显著水平。4.2.5 提高作物抗逆性能力接种菌株与基质处理相比，能够减轻作物病虫害发生(病情指数)，或提高作物抗倒伏、抗旱、抗寒、克服作物连作障碍等方面的能力，t检验达到显著水平。4.2.6 改良和修复土壤功能4.2 6.1 改良土壤功能接种菌株与基质处理相比，能够改善土壤容重、因粒结构、养分供给，以及土壤中的微生物种群结构与数量等，t检验达到显著水平。4. 2 6. 2 修复土壤功能接种菌株与基质处理相比，能够减少试验作物或土壤中的残留农药、重金属等有毒有害物质的含量，t检验达到显著水平。5 试

8、验方法5. 1 可溶性磷按附录A规定执行。2 NY/T 1847-2010 5.2 固氮能力按NY/T1735规定执行。5.3 解饵能力按NY882规定执行。5.4 可溶性钙、续或硫按NY1117规定执行。5.5 活性物质按NY882规定执行。5.6 纤维素酶活力按附录B规定执行。5. 7 木聚糖酶活力按附录C规定执行。5. 8 蛋白酶活力按附录D规定执行。5.9 作物晶质按NY/T1536规定执行。5.10 作物抗逆性按NY/T1536规定执行。5. 11 改良和修复土壤按NY/T1536规定执行。6 评价规则菌株符合4.1要求，并符合4.2要求中的任一项，评定其达到生产菌株的要求，可作为微

9、生物肥料生产菌株。3 NY/T 1847-2010 附录A(规范性附录)可溶性磷的测定方法A1 范围本标准规定了用铝锦抗比色法测定微生物肥料生产菌株溶解难溶性磷能力的方法。本标准适用于微生物肥料生产菌株溶解难溶性磷能力的测定。A.2原理在酸性条件下，磷酸盐与铝酸镀形成黄色镑磷铝混合杂多酸络合物，在锐剂存在下，用抗坏血酸将其还原生成蓝色络合物，在一定浓度范围内其颜色深浅与磷的含量成正比。因此可根据测定样品吸光度计算出可溶性磷的含量。A.3 培养基葡萄糖10 g CNH4)2 SO, 0.5 g MgS04 7H20 0.3 g NaCl 0.3 g KCl 0.3 g FeS04 4H, O 0

10、.036 g MnS04 4H20 0.03 g 蒸馆水1000口lLpH 7.0 元机磷源可为Ca3CP04)2、A1P04或FeP04 4H，O中的一种，加入量为10g;有机磷源为卵磷脂或植酸钙等，加入量为2.0g , A.4 试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。A 4.1 氢氧化纳溶液(100g/U，称取10g氢氧化纳CNaO日)溶于1mL水中。A 4.2 硫酸溶液(体积分数5%)，吸取5mL浓硫酸缓缓加入90mL水中，冷却后加水至100mL, A. 4. 3 酒石酸锈钢溶液(5g/L)称取酒石酸锈钢KSbOC4H406 1/2H20

11、)0. 5 g，溶于100mL水中。A 4. 4 铝锦贮存溶液z浓硫酸(日2S04)153mL缓慢倒入约400mL水中，同时搅拌。放置冷却。另称10 g铝酸钱CNH，)6Mo70 4H20J溶于约60C的300mL蒸馆水中，冷却。将配好的硫酸溶液缓缓倒入铝酸钱普车液中，同时搅拌。随后加入5g/L酒石酸锈钢溶液CA.4. 3) 100 mL，最后用蒸馆水稀释至1000 mL，避光保存。A 4. 5 铝锐抗显色弗U，称取1.50g抗坏血酸CC6Hs06，左旋，旋光度十21十22)加入到100mL铝锐贮存液CA.4. 4)中。此液须随配随用。A. 4. 6 二硝基盼指示剂:称取0.2g2，6二硝基盼

12、或是2，4二硝基盼H40HCNo，)，J溶于1mL水中o4 NY/T 1847-2010 A. 4. 7磷标准贮备溶液(100mg/U , 0. 439 0 g磷酸二氢绑(KH，P04，1050C烘2h)溶于100mL蒸馆水中，加入5mL浓硫酸，定容至1000mL。A. 4. 8 磷标准溶液(5mg/U，吸取磷标准贮备熔液(A.4. 7) 10 mL于200mL容量瓶中，定容。此溶液不宜久存。A.5 仪器与设备A.5.1 分析天平感量O.000 19o A.5.2摇床。A.5.3 离心机。A.5.4 分光光度汁.能检测350nm800 nm的吸光度范围。A.6 测定A. 6.1 待测菌株发酵培

13、养将活化好的待测菌株按一定比例接种到培养基中(A.3)，在适宜的条件下培养-定时间，即获得待测菌株的发酵产物。同时以加入等量的元菌水的发酵液做空白对照。A.6.2 标准曲线绘制分别吸取磷标准溶液(A.4. 8)OmL、1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL分别于50mL容量瓶中，加蒸馆水稀释至约30n止，加二硝基盼指示剂(A.4.6)2滴，用氢氧化纳溶液(A.4.1)或稀硫酸溶液(A.4. 2)调节pH至溶液刚呈微黄色。然后加入铝锐抗显色剂(A.4. 5)5 mL，摇匀，定容，即得O.Omg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.

14、4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L标准系列溶液。在室温高于15C的条件下放置30min后，在分光光度计上用波长700mn比色，读取吸光度。以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制标准曲线或建立回归方程。A. 6. 3 样品测定将样品(A.6. 1)4000 r/min离心20min后，吸取上清液5mL10mL(含磷5g25周，如超过此范围可适当稀释)于50mL容量瓶中，加水稀释至约30mL，加二硝基盼指示剂(A.4.6)2商，用氢氧化纳溶液(A.4. 1)或稀硫酸溶液(A.4. 2)调节pH至溶液刚呈微黄色。然后加入铝锵抗显色剂(A.4.5)5mL，摇匀，定容。在室温高于150C的条件下

15、放置30min后，以空白试验溶液作参比调零点，与标准溶液系列同条件显色、比色，读取吸光度。从工作曲线上查出所测吸光度对应磷的质量浓度(P)。A.7 结果计算按照下式计算磷的含量:x=P主主l三五V2 式中zX一-培养液中磷的含量(mg/L); P-工作曲线查得磷的质量浓度(mg/L), Vj-一显色液体积(mL); K 稀释倍数;V, 吸取主i青液体积(mLl。A.8 重复性.(1) 每个试祥取两份平行样进行分析测定，所得结果相对误差不超过10%，测定结果用二者算术平均值表示。5 NY/T 1847-2010 附录B(规范性附录)纤维素酶活力的测定方法滤纸法. 1 范围本标准规定了以滤纸为底物

16、，用还原糖比色法测定微生物肥料生产菌株产纤维素酶活力的方法。本标准适用于微生物肥料生产菌株产纤维素酶活力的测定。B.2原理纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大吸收，在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应液的吸光度成正比。B.3 单位定义在50C，pH5. 5条件下，1g(mL)样品1min降解滤纸产生1g葡萄糖为1个酶活力单位，以u/g (mL)表示。B.4 试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。B. 4. 1 氢氧化纳溶液(2g/L)，称取氢氧

17、化纳(NaOH)20. 0 g，加入100mL水榕解。B. 4. 2 拧橡酸溶液(0.1mol/ L)，称取拧橡酸(C6H807 H, O)2.10 g，加水溶解定容至100mL。B.4.3 拧橡酸纳溶液(0.1 mol/ L)，称取拧稼酸纳(Na，CHs07 2H, O)2. 94 g，加水溶解定容至100mL。B. 4. 4 拧橡酸盐缓冲液(0.05 mol/ L , pH5. 5)称取拧橡酸(C，HS07 H, O)lO.5 g，加入氢氧化纳(NaOH)5. 0 g，再加800mL水溶解，用拧橡酸溶液(B.4. 2)或拧橡酸纳溶液也4.3)调节pH至5.5，再加水定容至1000mL。B.

18、 4. 5 葡萄糖标准溶液(10.0mg/ mL)，将葡萄糖在恒温干燥箱中105C下干燥至恒童，称取1g，精确至0.0001g，加拧棱酸盐缓冲液(B.4. 4)溶解，定容至100mL B. 4. 6 3，5一二硝基水杨酸溶液(DNS)称取3，5二硝基水杨酸3.15g，加水500mL搅拌溶解，水浴至45C，然后逐步加入NaOH溶液(B.4. 1) 100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入四水酒石酸锦纳CC4瓦KNa，.4日20)91.0 g、苯盼CCH，0)2.50 g、无水亚硫酸纳(Na，S03)2.50 g，不断搅拌，直到物质完全溶解，冷却到室温后，定容至1000mL。过滤，将滤

19、液贮存于棕色瓶中，避光保存。室温放置7d后使用，有效期6个月。B. 4. 7 新华I号滤纸:将待用滤纸放入干燥器中平衡24h，平衡后的滤纸制成1.0 cmX 6. 0 cm。. 5 仪器与设备B. 5.1 分析天平:感量为O.01g。B. 5. 2 pH计:精确至0.010B. 5. 3 分光光度计能检测350nm800 nm的吸光度范围。B. 5. 4 离心机。B.5.5 恒温水浴锅:精度士O.2C 0 B.5.6 摇床。B. 5. 7磁力搅拌器z附加热功能。B.5.8 电磁振荡器。B.6 测定B. 6.1 待测菌株的发酵培养NY/T 1847-2010 将活化好的待测菌株按定比例接种到最适

20、发酵培养基中，在适宜的条件下培养定时间，即获得待测菌株的发酵产物。B. 6. 2 纤维素酶液的制备称取发酵产物(B.6.1)5. 00 g或5.00mL于三角瓶中，根据需要加入定体积拧橡酸盐缓冲液(B.4) , 200 r/min摇床振荡30min后，于5000r/min离心10min，上清液即为待W酶液，再用拧擦酸盐缓冲液(B.4. 4)做适当稀释(推荐浓度范围为酶活力7u/mL32 u/mLl。B. 6. 3 标准曲线的绘制B. 6. 3.1 分别吸取葡萄糖标准溶液也.4.5)0.00mL、乙OOmL、3.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00 mL，分别用拧棱酸盐

21、缓冲液(巴4.4)定容至50mL，配成浓度为0g/mL、400g/mL、6g/mL、800g/mL、1200g/mL、1600g/mL和2000卢g/mL的葡萄糖系列标准溶液。B. 6. 3. 2 分别吸取葡萄糖标准溶液(B.6. 3. 1)各1.00mL于25mL具塞比色管中，各加2.00mL水和2.00mLDNS试剂(B.4. 6)，沸水浴5mino冷却至室温，用水定容至25mL。在540nm波长下，以0卢g/mL葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，分别测定各浓度标准溶液的吸光度。以吸光度为横坐标，标准葡萄糖洛?夜浓度为纵坐标，列出直线囚归方程。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。B.

22、 6. 4 样品测定B. 6. 4.1 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液(B.6. 2) , 500C水浴平衡10mino B. 6. 4. 2 在25mL具塞比色管中加入滤纸条CB.4. 7)一一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL拧橡酸盐缓冲液CB.4. 4)浸润滤纸片，50oC水浴平衡10min，再依次加入2.00mL DNS试剂(B. 4. 6)、0.5mL酶液也6.1)、5mL水，电磁振荡3s5 s，50oC水浴中保温60min，然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至窒温，用水定容至25mL。以0卢g/mL葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，在540m波:时t测定吸光度A，0 B

23、. 6. 4. 3 在25mL具塞比色管中加人滤纸条CB.4. 7)一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL拧橡酸盐缓冲液CB.4. 4)浸润滤纸片，50oC水浴平衡10min，再依次加人0.5mL酶液也.6.4.1)和5mL水，电磁振荡3s5 s，50oC水浴中保温60min，加入2.00mLDNS试剂(旦4.6)，然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL以0g/mL葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，在540m波长处测定吸光度儿。B.7 试样酶活力的计算按照下式计算样品的滤纸纤维素酶活性:CA2-A，)XK十bXD. (1) 式中-X一一-样品纤维素酶活力u/gC m

24、L); 7 NY/T 1847-2010 A1 酶空白样的吸光度;A2 酶反应液的吸光度;K 标准曲线的斜率;b 标准曲线的截距;D一一试样的总稀释倍数;t一一反应时间Cmin)。B.8 重复性每个试样取两份平行样进行分析测定，所得结果相对误差不超过20%，测定结果用二者算术平均值表示。8 NY/T 1847-2010 附录C(规范性附录)木聚糖酶活力的测定方法C. 1 范围本标准规定了用分光光度法测定微生物肥料生产菌株产木聚糖酶活力的方法。本标准，:用于微生物肥料生产菌株产木聚糖酶活力的测定。C.2 原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5二硝基水杨

25、酸CDNS)试:JfIJ发生显色反应。反应颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖的活力成正比。因此通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。C. 3 酶活单位定义在50C、pH5.5条件下，1g(mL)样品在lmin内水解木聚糖底物，产生相当于1g木糖的还原糖的酶量为1个酶活力单位，以u/g(mL)表示。C. 4 试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。C.4. 1 氢氧化纳溶液(200g/L) ，称取氢氧化纳(NaOH)20.0 g，加人100mL水溶解。C. 4. 2 乙酸溶液(0.

26、1 mol/ mL)吸取冰乙酸(C，町0，)0.60mL，加水溶解，定容至100mLo C. 4. 3 乙酸纳溶液(0.1mol/mL) ，称取三水乙酸锅(C，H3NaO， 3日20)1.36g，加水溶解，定容至100mL。C. 4. 4 乙酸乙酸纳缓冲液(0.1mol/mL. pH 5. 50)，称取三水乙酸纳(C，凡NaO， 3H20)23. 14 g , 加人冰乙酸(C，H，O，)1.70mLo加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH，如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液化.4.2)或乙酸销(C.4. 3)调节至pH5. 50。C. 4. 5 木糖溶液(10.0mg/ mL)，称取元水

27、木糖(C与日1005)1.000g，用乙酸乙酸纳缓冲液化.4.4)溶解后定容至100mL。C. 4. 6 木聚糖溶液.称取木聚糖(SigmaX0627) 1. 00 g，加人0.32g氢氧化纳(NaOH)，加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热直至完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min后，加入0.5mL冰乙酸(C，H40，)。继续磁力搅拌，测定其pK如果pH为5.50，用乙酸一乙酸纳缓冲液化.4.4)定容至100mL。如果偏离5.50，再用乙酸溶液cc.4. 2)或乙酸饷(C.4. 3)调节至5.50后，用乙酸一乙酸纳缓冲液化.4.4)定容至100mL，40C避光保存，有效期12h。C.

28、4. 7 3，5二硝基水杨酸溶液CDNS)，见B.4.6oC. 5 仪器与设备见B.5o9 NY/T 1847-2010 C.6测定C. 6. 1 待测菌株的发酵培养将活化好的待测菌株按一定比例接种到最适发酵培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，即获得待测菌株的发酵产物。C. 6. 2 待测酶液的制备称取发酵产物cc.6. 1)5. 00 g或5.00mL于三角瓶中，根据需要加入一定体积的乙酸乙酸纳缓冲液CC.4.份，200r/ min摇床振荡30min后，5000r/min离心10min，上清液即为待测酶液，再用乙酸乙酸纳缓冲液CC.4. 4)做适当稀释(推荐浓度范围为酶活力6u/mL15

29、u/mL)。C. 6. 3 标准曲线绘制C. 6. 3. 1 吸取乙酸一乙酸纳缓冲液Cc.4. 4)4. 0 mL，加入DNS试剂Cc.4. 7) 5.0 mL，沸水浴加热5mm。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。C. 6. 3. 2 分别吸取术糖溶液CC.4. 5) 1. OOmL、2.00mL、3.00mL、OOmL、丘。OmL、6.00mL和7.00mL，分别用乙酸乙酸纳缓冲液Cc.4. 4)定容至100mL，配制成浓度为100g/mL、200g/mL、300g/mL、400g/mL、500g/mL、6g/mL和700卢g/mL水糖标准溶液。C. 6. 3. 3

30、 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.0mLC做两个平行)，分别加入到具塞比色管中，再分别加入2.0mL乙酸乙酸纳缓冲液Cc.4. 4)和5.0mLDNS试fiJCC.4. 7)。电磁振荡3s., 5 s，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25mL，以标准空白样Cc.6. 3.1)为对照调零，在540 nm处测定脱光度A。以木糖浓度为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。C. 6. 4 样品测定C. 6. 4. 1 吸取10.0mL木聚糖溶液CC.4.6)，50C平衡20min。吸取10.0mL经适当释的待测酶液CC. 6. 2

31、)，50C平衡20min。C. 6. 4. 2 吸取2.0mL待测酶液化.6.4.1)，加入到具塞比色管中，再加入DNS试剂Cc.4. 7)5. 0 mL, 电磁振荡3s5 s。加入2.0mL术聚糖溶液CC.4. 6) ，50C保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，电磁振荡3s5 s，以标准空白祥Cc.6. 3. 1)为对照调零，在540nm 处测定吸光度AC. 6. 4. 3吸取2.0mL待测酶液Cc.丘4.1)，加入到j具塞比色管中，.再加入2.0mL木聚糖溶液CC. 6. 4.1)，电磁振荡3s5 s，50C保温30min，加入DNS试剂Cc.4

32、. 7)5. 0 mL，电磁振荡3s.5 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，电磁振荡3s5 s。以标准空白样Cc.6. 3. 1)为对照调零，在540nm处测定吸E度A2。C. 7 酶活力计算按照下式计算样品的木聚糖酶的活力tx=CA2 -A,) XK十毡兰2.HH-. (1) 式中X 样品木聚糖酶活力u/gCmL) J; A, 酶空白样的吸光度;A2 酶反应液的吸光度，K 标准曲线的斜率;b 标准曲线的截距;10 D-一试样的总稀释倍数;t一-反应时间(min)。C8 重复性NY/T 1847-2010 每个试样取两份平行样进行分析测定，所得

33、结果相对误差不超过10%，测定结果用二者算术平均值表示。11 NY/T 1847-2010 附录D(规范性附录蛋白酶活力的测定福林法D.1 范围本标准规定了用福林法测定微生物肥料生产菌株产蛋白酶活力的方法。本标准适用于微生物肥料生产菌株产蛋白酶活力的测定。D.2 原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解略素底物，产生含有盼基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成铝蓝与鸽蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度，酶活力与吸光度成比例，由此可以汁算样品酶活力。D.3 单位定义在一定温度和pH值条件下，1g(mL)样品1min水解酶素产生1E酶氨酸为1个酶活力单位，以u/ g(mL)表

34、示。D.4 试剂和溶液自己制除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。D. 4. 1 福林试剂的制备:于2000mL磨口回流装置中加入锅酸销(NazW04 2H20) 100.0 g、铝酸纳(Na2M004 2H20)25 g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸钮(Li2SO，)50g ,7.K 50 mL和数滴浓澳水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溪水(冷却后仍有绿色需再加澳水，再煮沸除去过量的澳)，冷却，加水定容至10mLo 昆匀，过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。D

35、. 4. 2 福林使用液:1份福林试剂(D.4. 1)与2份水混合，摇匀。也可用市售福林溶液配制。D. 4. 3 碳酸纳溶液(0.4mol/L)称取元水碳酸锅(Na2C03)42.4 g，用水溶解并定容至1000mL。D. 4. 4 三氯乙酸(0.4mo/L):称取二氯乙酸(CCl， COOH)65. 4 g，用水溶解并定容至10mL。D. 4. 5 氮氧化纳溶液(0.5mol/L):称取20g氢氧化纳(NaOH)，溶于9mL水中，待溶液冷却到室温后定容至1000mL。D. 4. 6 盐酸溶液(1mol/L):量取90mL浓盐酸，注入1000mL水，摇匀。D. 4. 7 盐酸溶液(0.1mol

36、/L) ，量取9mL浓盐酸，注入1000rnL水，摇匀。D. 4. 8 磷酸缓冲液(pH7.5，适用于中性蛋白酶):称取磷酸氢二纳(Na2日P04 12日20)6.02g和磷酸二氢纳(NaH，P; 2H2)0. 5 g，加水溶解并定容至1000mL。D. 4. 9 乳酸纳缓冲液(pH3.0，适用于酸性蛋白酶):取乳酸(C3H603)(80%90%)4.71 g和乳酸饷(CH3日5Na03)(70%)0.89吉，加水至900mL，搅拌至均匀，用乳酸或乳酸饷调整pH到3.。土0.05，定容至1000mL。D. 4.10棚酸缓冲液(pH10.5，适用于碱性蛋白酶)，称砌酸纳(NaB407)9.54日

37、，氢氧化纳(NaOH)1.60 g，加水至900mL.搅拌至均匀。用盐酸(0.4.6)或氢氧化铀溶液CD.4. 5)调整pHU 10. 5土0.05，NY/T 1847-2010 定容至1000mL。D. 4.11 赂蛋白溶液(10g/U:称取赂蛋白1.000 g，用少量氢氧化纳溶液(0.4.5)(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2滴3滴)湿润后，加入相应的缓冲液约80rnL，在沸水浴中加热煮沸30rnin，并不时搅拌，直至完全溶解，冷却后转人100mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，定容前检查并调整pH至相应缓冲液的规定值。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。D.

38、4.12 L赂氨酸标准溶液(100严g/rnU:称取预先于105C干燥至恒重的L-路氨酸。.1000g，用盐酸(D.4. 6) 60 rnL溶解后定容至100rnL，为1rng/rnL酶氨酸标准溶液。吸取1rng/rnL胳氨酸标准溶液10.rnL，用盐酸(D.4. 7)定容至100rnL，即得到100卢g/rnL的L酶氨酸标准溶液。D.5 仪器与设备见B.5。D.6 测定D. 6.1 待9!a菌株的发酵培养将活化好的待测菌株按定比例接种到最适发酵培养基中，在适宜的条件下培养定时间，即获得待测菌株的发醇产物。D.6.2 待9!J酶液的制备称取发酵产物(D.6. 1)5. 00 g或5.00rnL

39、于三角瓶中，加入定体积的相应缓冲液，并稀释到-定浓度(推荐浓度范围为酶活力10u/ rnL 15 u/ rnU ，然后200r/rnin摇床振荡30rnin后，再3000r/rnin 离心20rnin，上清液即为待测酶液。D. 6. 3标准曲线绘制D. 6. 3.1 分别吸取L-胳氨酸标准溶液(0.4.12)0.00rnL、1.00 rnL、2.00rnL、3.00rnL、4.00rnL、5.00mL，分别用水补足到至10rnL，配制成浓度为0g/rnL、10卢g/rnL、20g/rnL、30g/mL、40g/rnL、50卢g/rnLL赂氨酸标准溶液。D. 6. 3. 2 分取上述榕液各1.0

40、0 rnL(做2个平行)，各加碳酸毛的溶液(0.4.3)5.00rnL、福林试剂使用溶液(0.4.2)1.00mL，置于40C士0.2C恒温水浴中显色20min后取出。用分光光度计于680nm，以不含L路氨酸的标准溶液为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，赂氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。D. 6. 4样晶测定D. 6. 4.1 将路蛋白(0.4.11)溶液放入40C土0.2C恒温水浴中，预热5min。D. 6. 4. 2 吸取待测酶液(D.6. 2) 1. 00 rnL放人试管中，置于40C土0.2C恒温水浴中2min。加入三氯乙酸(0.4.4)2.00mL，摇匀，置于40C士0.2

41、C恒温水浴中30min，再加赂蛋白溶液(0.6.4.1)1.00 rnL，摇匀。静止10min后过滤(慢速定性试纸)，取滤液1rnL加人另一试管中，再加人碳酸纳溶液(0. 4. 3) 5. 00 mL、福林试ifiJ使用液(0.4. 2) 1. 00 rnL，置于40C士0.2C恒温水浴中显色20rnin后取出，作为空白对照。D. 6. 4. 3 吸取待lJ!d酶液(D.6. 2) 1. 00 rnL放入试管中(需作两个平行试样)，置于40C土0.2C恒温水浴中2rnin，加入赂蛋白溶液(0.6. 4. 1) 1. 00 rnL，摇匀，置于40C士O.ZC恒温水浴中30rnin。再加入三氯乙酸

42、2.00rnL，摇匀。静止10min后过滤(慢速定性试纸)。取滤液1.00rnL加入另一试管中，再加人碳酸纳溶液(D.4. 3) 5. 00 rnL、福林试JlIJ使用液(0.4.2)1. 00 mL，置于40C土0.2C恒温水浴中显色ZOrnin后取出。D 6.4.4 用分光光度计于680nm波长下，以空白对照调零点，测试样吸光度。13 NY/T 1847-2010 D.7 计算样品的蛋白酶活力按式(1)计算.AX4XD x= . (1) t 式中zx 样品的酶活力u/g(mL)卫A 由标准曲线得出的样品最终稀释液的酶活力(u/mL); 4 反应试剂的总体积(mL);D 试样的总稀释倍数;t一一-反应时间(min)。D8 重复性每个试样取两份平行样进行分析测定，所得结果相对误差不超过10%.测定结果用二者算术平均值表示。14