GB 5413.9-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定.pdf

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1、 中华人 民共和国国家标准GB 5413.92010中华人民共和国卫生部发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A、 D、 E 的测定 National food safety standard Determination of vitamin A, D, E in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.92010 I 前 言 本标准代替 GB/T 5413.9-1997婴幼儿配方食品和乳粉 维生素 A、 D、 E的测定。 本标准与

2、 GB/T 5413.9-1997相比，主要变化如下： 抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸； 将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作； 增加了标准溶液的校正； 将原有的单点定量改为标准曲线法； 增加了维生素 D回收率的测定； 将计算公式进行修改。 本标准附录 A为规范性附录，附录 B为资料性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB 5413-1985、 GB/T 5413.9-1997。 GB 5413.92010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A、 D、 E 的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 A、 D、 E的测定方法。 本标准适用于婴

3、幼儿食品和乳品中维生素 A、 D、 E的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 原理 试样皂化后，经石油醚萃取，维生素 A、 E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素 D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为 GB/T 6682规定的一级水。 4.1 -淀粉酶：酶活力 1.5 U/mg。 4.2 无水硫酸钠。 4.3 异丙醇：色谱纯。 4.4 乙醇：色谱纯

4、。 4.5 氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾 250 g，加入 200 mL 水溶解。 4.6 石油醚：沸程 30 60 。 4.7 甲醇：色谱纯。 4.8 正己烷：色谱纯。 4.9 环己烷：色谱纯。 4.10 维生素 C 的乙醇溶液（ 15 g/L）。 4.11 维生素 A、 D、 E 标准溶液 4.11.1 维生素 A 标准储备液（视黄醇）（ 100 g/mL）：精确称取 10 mg 的维生素 A 标准品，用乙醇（ 4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 GB 5413.92010 2 4.11.2 维生素 E 标准储备液（ -生育酚）（ 500 g/mL）：精确称取 50 m

5、g 的维生素 E 标准品，用乙醇（ 4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.3 维生素 D2标准储备液（ 100 g/mL）：精确称取 10 mg 的维生素 D2标准品，用乙醇（ 4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.4 维生素 D3标准储备液 （ 100 g/mL） ：精确称取 10 mg 的维生素 D3标准品，用乙醇（ 4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 注： 维生素 A、 D、 E标准储备液均须 -10以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附录 A。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪，带紫外检测器

6、。 5.2 旋转蒸发器。 5.3 恒温磁力搅拌器： 20 80 。 5.4 氮吹仪。 5.5 离心机：转速 5000 转 /分钟。 5.6 培养箱： 60 2 。 5.7 天平：感量为 0.1 mg。 6 分析步骤 6.1 试样处理 6.1.1 含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约 5 g或液体试样约 50 g（精确到 0.1 mg）于 250 mL三角瓶中，加入 l g -淀粉酶（ 4.1），固体试样需用约 50 mL 45 50 的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60 2 培养箱（ 5.6）内培养 30 min。 6.1.2 不含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约 10 g或

7、液体试样约 50 g（精确到 0.1 mg）于 250 mL三角瓶中，固体试样需用约 50 mL 45 50 水使其溶解，混合均匀。 6.2 测定维生素 D 的试样需要同时做回收率实验。 6.3 待测液的制备 6.3.1 皂化：于上述处理的试样溶液中加入约 100 mL 维生素 C 的乙醇溶液（ 4.10），充分混匀后加25 mL 氢氧化钾水溶液（ 4.5）混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。 1000 mL 的烧杯中加入约 300 mL 的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器（ 5.3）上，当水温控制在 53 2 时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约 45 min 后，取出立刻冷却到室温

8、。 6.3.2 提取：用少量的水将皂化液全部转入 500 mL 分液漏斗中，加入 100 mL 石油醚（ 4.6），轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约 10 min 后静置分层，将水相转入另一 500 mL 分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入 500 mLGB 5413.92010 3 圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在 40 2 充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至 10 mL 容量瓶中，定容。 6.3.3 从上述容量瓶中准确移取 2.0 mL 石油醚溶液放入试管 A 中，再准确移取 7.0 mL 石油醚溶液放

9、入另一试管 B 中，将试管置于 40 2 的氮吹仪（ 5.4）中，将试管 A 和 B 中的石油醚吹干。向试管A 中加 5.0 mL 甲醇（ 4.7），振荡溶解残渣。向试管 B 中加 2.0 mL 正己烷（ 4.8），振荡溶解残渣。再将试管 A 和试管 B 以不低于 5000 转 /分钟的速度离心 10 min，取出静置至室温后待测。 A 管用来测定维生素 A、 E， B 管用来测定维生素 D。 6.4 测定 6.4.1 维生素 A、E 的测定 6.4.1.1 色谱参考条件 色谱柱： C18柱， 250 mm 4.6 mm， 5 m，或具同等性能的色谱柱。 流动相：甲醇（ 4.7）。 流速： 1

10、.0 mL/min。 检测波长：维生素 A： 325 nm；维生素 E： 294 nm。 柱温： 35 1 。 进样量： 20 L。 6.4.1.2 维生素 A、 E 标准曲线的绘制 分别准确吸取维生素 A 标准储备液（ 4.11.1） 0.50 mL、 1.00 mL、 1.50 mL、 2.00 mL、 2.50 mL 于50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 1.00 g/mL、 2.00 g/mL、3.00 g/mL、 4.00 g/mL、 5.00 g/mL。 分别准确吸取维生素 E 标准储备液（ 4.11.2） 1.00 mL、 2.00 mL、

11、 3.00 mL、 4.00 mL、 5.00 mL 于50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 10.0 g/mL、 20.0 g/mL、30.0 g/mL、 40.0 g/mL、 50.0 g/mL。 分别将维生素 A、 E 标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录 B），得到峰高 (或峰面积 )。以峰高 (或峰面积 )为纵坐标，以维生素 A、 E 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 A、 E 标准曲线。 6.4.1.3 维生素 A、 E 试样的测定 将试液（ 6.3.3中 A管）注入液相色谱仪中，得到峰高 (或峰面积 )，根据各自标准曲线得到待测溶液

12、中维生素 A、 E的浓度。 6.4.2 维生素 D 的测定 6.4.2.1 维生素 D 待测液的净化 6.4.2.1.1 色谱参考条件。 色谱柱：硅胶柱， 150 mm 4.6 mm，或具同等性能的色谱柱。 流动相：环己烷（ 4.9）与正己烷（ 4.8）按体积比 1： 1混合，并按体积分数 0.8 %加入异丙醇（ 4.3）。 流速： 1 mL/min。 波长： 264 nm。 柱温： 35 1 。 进样体积： 500 L。 6.4.2.1.2 取约 0.5 mL维生素 D3标准储备液 （ 4.11.4） 于 10 mL具塞试管中， 在 40 2 的氮吹仪 （ 5.4）上吹干。残渣用 5 mL正

13、己烷振荡溶解。取该溶液 50 L注入液相色谱仪中测定，确定维生素 D保留时间。然后将 500 L待测液（ 6.3.3中 B管）注入液相色谱仪中，根据维生素 D标准溶液保留时间收集维生素 D馏分于试管 C中。将试管 C置于 40 2 条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入 1.0 mL甲醇（ 4.7），残渣振荡溶解，即为维生素 D测定液。 GB 5413.92010 4 6.4.2.2 维生素 D 测定液的测定 6.4.2.2.1 参考色谱条件 色谱柱： C18柱， 250 mm 4.6 mm， 5m，或具同等性能的色谱柱。 流动相：甲醇（ 4.7）。 流速： 1 mL/min。 检测波长： 264

14、 nm。 柱温： 35 1 。 进样量： 100 L。 6.4.2.2.2 标准曲线的绘制 分别准确吸取维生素 D2（或 D3） 标准储备液 （ 4.11.3、 4.11.4） 0.20 mL、 0.40 mL、 0.60 mL、 0.80 mL、1.00 mL 于 100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 0.200 g/mL、0.400 g/mL、 0.600 g/mL、 0.800 g/mL、 1.000 g/mL。 分别将维生素 D2（或 D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积 )，参见附录 B。以峰高 (或峰面积 )为纵坐标，以维生素 D2

15、（或 D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。 6.4.2.2.3 维生素 D 试样的测定 吸取维生素 D测定液（ 6.4.2.1中 C管） 100 L注入液相色谱仪中（色谱图参见附录 B），得到峰高（或峰面积），根据标准曲线得到维生素 D测定液中维生素 D2（或 D3）的浓度。 维生素 D 回收率测定结果记为回收率校正因子 f，代入测定结果计算公式（ 2），对维生素 D 含量测定结果进行校正 。 7 分析结果的表述 7.1 维生素 A 含量的计算 维生素 A 含量按（ 1）计算： mcXs10052/10 = （ 1） 式中： X试样中维生素 A的含量，单位为微克每百克（ g/100

16、g） ； C从标准曲线得到的维生素 A 待测液的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL） ； m 试样的质量，单位为克（ g）。 注： 1 g 视黄醇 = 3.33 IU 维生素 A。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 7.2 维生素 D 含量的计算 维生素 D 含量按（ 2）计算： fmcXs=100227/10（ 2） 式中： X试样中维生素 D2（或 D3）的含量，单位为微克每百克（ g/100 g） ； cs从标线得到的维生素 D2（或 D3）待测液的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL） ； m 试样的质量，单位为克（ g） ； GB 5413.

17、92010 5 f 回收率校正因子。 注： 试样中维生素 D 的含量以维生素 D2和 D3的含量总和计。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 7.3 维生素 E 含量 维生素 E 含量按（ 3）计算： 100010052/10=mcXs（ 3） 式中： X试样中维生素 E（ -生育酚）的含量，单位为毫克每百克（ mg/100 g） ； cs从标准曲线得到的维生素 E 待测液的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL） ； m试样的质量，单位为克（ g） 。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件

18、下获得的两次独立测定结果的绝对差值，维生素 A、 E不得超过算术平均值的 5%，维生素 D不得超过算术平均值的 10 %。 9 其他 本标准检出限：维生素 A 为 1 g/100 g、维生素 E 为 10.00 g/100 g、维生素 D 为 0.20 g/100 g。 GB 5413.92010 6 附录 A （规范性附录） 标准溶液浓度校正方法 维生素 A、 D、 E标准储备液配制后需要进行校正，具体操作如下： 分别取维生素 A、 D、 E标准储备液若干微升，分别注入至含有 3.00 mL乙醇的比色皿中，根据给定波长测定各维生素的吸光值，按表 A.1给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该

19、维生素的浓度。 表A.1 各维生素吸光值的测定条件 标准品 加入标准储备液的量 （ L） 比吸光系数%1cmE 波长 （ nm） 视黄醇（ A） V 1835 325 -生育酚（ E） V 71 294 麦角钙化甾醇（ D2） V 485 264 胆钙化醇（ D3） V 462 264 浓度计算按式 (4)： C=EA31000.31001V( 4) 式中： C维生素 A、 D、 E浓度，单位为克每毫升（ g/mL）； A维生素 A、 D、 E的平均紫外吸光值； V加入标准储备液的量，单位为微升（ L）； EA、 D、 E维生素 1 %比色光系数； 31000.3V标准储备液稀释倍数。 GB

20、5413.92010 7 附录 B （资料性附录） 标准品液相色谱图 B.1 维生素 A、E、D 3、D 2标准品液相色谱图 维生素 A、 E、 D3、 D2标准品液相色谱图见图 B.1图 B.4。 AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00维生素A-5.158图 B.1 维生素A标准品液相色谱图 AU0.0000.0020.0040.0060.0080.0100.0120.0

21、140.0160.018分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00维生素E-14.059图 B.2 维生素 E 标准品液相色谱图 GB 5413.92010 8 AU-0.0008-0.0006-0.0004-0.00020.00000.00020.00040.00060.00080.00100.00120.00140.00160.0018分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00维生素D3-11.486图 B.3 维生素D 3标准品液相色谱图 AU0.00000.00020.00040.00060.00080.00100.00120.00140.00160.00180.00200.00220.00240.00260.00280.00300.0032分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00维生素D2 -10.384图 B.4 维生素 D 2标准品液相色谱图