DB32 T 5359—2026 纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定 酶联免疫吸附法.pdf
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1、7,江苏省市场监督管理局发 布中 国 标 准 出 版 社出 版纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定 酶联免疫吸附法TextilesDetermination of reduction activity of allergen derived from pollen and mite and other sourcesEnzymelinked immunosorbent assay CCS W 04DB32/T 53592026ICS 59.080.012026-04-03 发布2026-05-03 实施DB32/T 53592026前言 引言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和
2、定义 14 原理 25 试剂和材料 26 仪器与设备 37 测试准备 38 过敏原标准曲线绘制 59 测试步骤 510 过敏原去除率计算与表示611 回收率612 重复性和再现性613 测试报告6附录 A(资料性)花粉、螨虫过敏原 7附录 B(资料性)试剂盒组成示例 8附录 C(资料性)酶联免疫吸附法:夹心 ELISA 法 9附录 D(资料性)过敏原标准曲线 10附录 E(资料性)回收率 11附录 F(资料性)实验室间对比结果12附录 G(资料性)重复性和再现性 15参考文献 17目 次DB32/T 53592026前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分:标准化文
3、件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江苏省市场监督管理局提出并组织实施。本文件由江苏省化学纤维标准化委员会归口。本文件起草单位:江苏省纺织产品质量监督检验研究院、中国药科大学。本文件主要起草人:卞莹、王鑫、周金香、李裕陆、邢然、龚贤荣、马文权、张祥琨、顾加雨、陈昌斌、成钢、李丽、刘艳容、樊文楚、叶青、刘冲、王磊、宋春常、仇兆波、崔宏恩、倪鑫茹、薛文文、董雨桐、孙姗姗、王思渊、戴国英、陆梅、蒋洁蓉。DB32/T 53592026引言经整理具有抗细菌、真菌、病毒等功能的纺织品,满足了消费者对健康和卫生的需求,自面世以来
4、其应用领域越来越广泛。一定条件下,可引发人体抗原-抗体反应的过敏原(如螨虫、花粉来源的过敏原)会通过污染纺织品给消费者的健康带来一些隐患。因此,经整理具有去除此类过敏原功能的高性能纺织品越来越受关注和青睐。这类高性能纺织品的研发、生产不仅涉及纺织技术还有生物技术。当前,由于缺乏现行有效的、规范统一的测试方法,不同测试结果之间不具有可比性,因此,无法为生产商、经销商、消费者以及市场监管部门有效评估此类经整理纺织品的去除过敏原功效提供依据。为满足市场各相关方获取纺织品去除过敏原性能准确评价的需求,本文件提供了一种基于酶联免疫吸附法(Enzymelinked immunosorbent assay,
5、ELISA)测定纺织品的螨虫、花粉等过敏原去除活性的试验方法。为响应此迫切需求,基于 ELISA,本文件提供了一种科学的、有效的、可行的,可测定纺织品的螨虫、花粉等过敏原去除活性的试验方法。需要说明的是,该测试方法不用于人体过敏原检测。DB32/T 53592026纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定 酶联免疫吸附法警告使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本文件描述了采用酶联免疫吸附法测定纺织品的花粉、螨虫等过敏原去除活性的方法。本文件适用于纤维、纱线、无纺布、机织物、
6、针织物、编织物等纺织品的花粉、螨虫等过敏原去除活性测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗原antigen被免疫系统识别为外来物,并诱发免疫反应生成抗体的物质。3.2抗体antibodyB 淋巴细胞响应外来物(抗原)而产生并分泌的,能够与对应抗原特异性结合的免疫球蛋白。注:免疫球蛋白是抗体的常
7、见同义词。3.3过敏原allergen能够诱发机体发生过敏反应的抗原物质,如来源于花粉、螨虫、霉菌、蟑螂或宠物等的特异性蛋白。注:花粉、螨虫过敏原示例见附录 A。3.4去除过敏原allergen reduction采用物理、化学、生物等方法减少或去除作用对象上过敏原的过程。3.5过敏原去除活性reduction activity of allergen在规定条件下试验后,试样过敏原浓度比空白对照组过敏原浓度减少的百分比。1DB32/T 53592026注 1:以过敏原去除率表示。注 2:有未经整理纺织品样品作为参比对照时,试验后,比较试样过敏原浓度比未经整理试样过敏原浓度减少的百分比。3.6过
8、敏原去除剂allergen reduction agents能够降低过敏原浓度的无机、有机化学物质,或生物学物质。3.7经整理纺织品treated textiles经过敏原去除剂整理的纺织品。3.8未经整理纺织品untreated textiles未经过敏原去除剂整理,材质和性能与经整理纺织品相同或相似的纺织品。注:测试中用作参比对照。3.9酶联免疫吸附法Enzymelinked immunosorbent assay;ELISA利用抗体(3.2)或抗原(3.1)与酶共价结合原理的测试方法。注:以酶作为标记指示物,以抗原抗体反应为基础,通过色原呈色程度进行结果判断的固相吸附测试方法。4原理在试
9、样和对照上,滴加一定浓度的过敏原工作溶液,在规定的温度下,接触、孵育一定时间,用 ELISA 法测定试样和对照上过敏原的浓度。通过比较接触、孵育后试样与对照上剩余过敏原浓度,计算过敏原去除率,以此表示试样的过敏原去除活性,评价试样去除过敏原的效果。5试剂和材料5.1通则所有试剂和材料应适用于生物学试验。5.2水符合 GB/T 6682 规定的三级水。5.3磷酸盐缓冲溶液(PBS)氯化钠 8.0 g氯化钾 0.2 g磷酸二氢钾 0.2 g十二水合磷酸氢二钠 2.83 g水 定容至 1 000 mL5.4含吐温20 的磷酸盐缓冲溶液(PBST)吐温20(Tween20)0.5 mLPBS(5.2)
10、定容至 1 000 mL2DB32/T 535920265.5过敏原溶液于-20 或以下温度保存过敏原溶液。于生物安全柜中,操作过敏原溶液。5.6过敏原工作溶液取已知浓度的过敏原溶液,用 PBST(5.4)稀释,配制成浓度为 10 ng/mL20 ng/mL 的过敏原工作溶液。如需要,浓度可调至 100 ng/mL。工作溶液现用现配。于生物安全柜中,操作过敏原工作溶液。5.7过敏原测定 ELISA 试剂盒5.7.1过敏原测定 ELISA 试剂盒组成见附录 B。试剂盒按照 GB/T 33411 评价,检出限不低于 0.5 ng/mL。5.7.2可购买市售试剂盒并按照说明配制和使用。检出限不低于
11、0.5 ng/mL。6仪器与设备6.1容量瓶:1 000 mL、50 mL,A 级。6.2天平:精确度 0.1 g 和 0.000 1 g。6.3微量可调移液器及配套吸头:10 L、200 L、1 000 L。6.4冰箱:工作温度范围 2 8 和(-202)。6.5生物安全柜:级。6.6培养箱:工作温度(251),(371)。6.7酶标仪:波长范围 450 nm620 nm,最大允许误差:5 nm。6.8 聚乙烯自封袋:(602)mm(852)mm。6.9凝胶过滤柱:填料为葡聚糖凝胶 G25;凝胶颗粒直径为 85 m260 m。7测试准备7.1试样按照表 1 规定大小或重量,直接剪取或称取试样
12、共制备试样 6 个,其中 3 个用于灵敏度验证试验(7.3),剩余 3 个用于测试(第 9 章)。表 1 试样制备样品类型织物(机织物、针织物、无纺布)纤维、纱线、编织物、填絮或羽绒 a 尺寸为(502)mm(502)mm 的织物试样重量。样品规格 a/g0.400.40试样(502)mm(502)mm(0.400.05)g(0.400.05)g3DB32/T 535920267.2对照7.2.1空白对照取 3 个聚乙烯自封袋(6.8)作为空白对照。7.2.2参比对照如有未经整理纺织品样品,可作为参比对照。按照表 1 规定,制备 6 个未经整理试样,其中 3 个用于灵敏度验证试验(7.3),
13、剩余 3 个用于测试(9)。7.3ELISA 灵敏度验证试验7.3.1步骤7.3.1.1 取 3 个试样(7.1)分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8),各加入 1 000 L PBST(5.4)。7.3.1.2如有作为参比对照的未经整理试样(7.2.2),取 3 个分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8),各加入1 000 L PBST(5.4)。7.3.1.3折叠自封袋中的试样(或作为参比对照的未经整理试样),不少于 4 层,立即挤压试样数次,取出试样,回收样液。7.3.1.4用移液器分别取各自封袋中回收液 100 L,加入相应过敏原抗体包被板(B.1)微孔中。每份回收液各 2 孔。7.3.
14、1.5另取 2 孔包被板(B.1)微孔,各加入 100 L PBST(5.4)。以此作为阴性对照。7.3.1.6将包被板置于培养箱(6.6)中,25,孵育(305)min 后,去除反应孔中液体。用 300 L PBST(5.4)洗板,重复洗板步骤,共洗 3 次。7.3.1.7用移液器吸取 100 L 过敏原工作溶液(5.6)加入包被板(B.1)各微孔中,参照附录 C 方法完成测试。利用标准曲线计算过敏原浓度,单位为 ng/mL,保留 2 位小数。7.3.2要求计算试样和阴性对照的过敏原浓度,ELISA 灵敏度验证应满足公式(1):|()Sn-StSn|100 20%(1)式中:Sn3 个阴性对
15、照测得的过敏原浓度均值,单位为纳克每毫升(ng/mL),保留 2 位小数;St 3 个试样回收液测得的过敏原浓度均值,单位为纳克每毫升(ng/mL),保留 2 位小数。如有作为参比对照的未经整理试样,则 ELISA 灵敏度验证应满足公式(2):|()Sn-SuSn|100 20%(2)式中:Su3 个未经整理试样回收液测得的过敏原浓度均值,单位为纳克每毫升(ng/mL),保留 2 位小数。上述数值20%时,说明样品基质(除分析物外的化学物质)没有影响 ELISA 测试结果准确性。如果数值20%,说明回收液(7.3.1.4)中所含化学物质对 ELISA 测试结果产生影响,需将回收液纯化后再验证,
16、按照 7.3.3 操作。7.3.3回收液纯化及验证7.3.3.1用移液器将各自封袋袋中的回收液(7.3.1.4)转移至凝胶过滤柱(6.9)。按照市售过滤柱说明书4DB32/T 53592026进行纯化操作,回收滤液。7.3.3.2分别取各滤液 100 L,加入包被板(B.1)微孔中。每份样液各 2 孔。7.3.3.3其余操作同 7.3.1.57.3.1.7。7.3.3.4按照 7.3.2 验证,直至数值20%。8过敏原标准曲线绘制8.1选取浓度介于检测限浓度与 20 ng/mL 之间的 7 个点绘制过敏原标准曲线。8.2采用 2 倍稀释,用 PBST(5.4)稀释已知准确浓度的过敏原标准溶液。
17、8.3用移液器吸取 100 L 各浓度过敏原标准溶液,加入过敏原抗体包被板(B.1)微孔中。每个浓度各 2 孔。8.4参照附录 C 方法,测定各浓度过敏原标准溶液对应的 450 nm 处的吸光度值(OD)。8.5参见附录 D,绘制过敏原标准曲线。每次试验均绘制标准曲线。经适当验证后,其他过敏原标准曲线也可使用。9测试步骤9.1准备9.1.1试样取 3 个试样(7.1)分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8),用移液器吸取 1 000 L 过敏原工作溶液(5.6),滴加在试样中心,封口。如试样吸收过敏原工作溶液过多,导致自封袋中样液过少,可增加过敏原溶液至5 000 L。9.1.2对照9.1.2.
18、1空白对照取 3 个聚乙烯自封袋(6.8),加入与 9.1.1 相同体积的过敏原工作溶液,封口。9.1.2.2参比对照如有未经整理试样作为参比对照(7.2.2),取 3 个分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8),用移液器吸取与9.1.1 相同体积的过敏原工作溶液(5.6),滴加在未经整理试样中心,封口。9.2接触孵育将准备好的自封袋(9.1)放入培养箱(6.6)中,25,静置,接触孵育 2 h。协议双方可根据需要规定孵育时间,不宜超过 24 h。9.3样液回收静置孵育结束后,折叠自封袋中的试样,不少于 4 层,挤压试样数次后,取出试样(或作为参比对照的未经整理试样),回收样液。如 ELISA
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