DB13 T 2894-2018 动物尿液中苯乙醇胺A的测定 酶联免疫吸附法.pdf

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1、ICS 11.220 B 42 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 2894 2018 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 2018 - 12 - 13 发布 2018 - 12 - 31 实施 河北省 市场监督管理局 发布 DB13/T 2894 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由 河北省农业厅 提出。 本标准起草单位：河北省科学院生物研究所、河北省兽药监察所、石家庄市畜产品质量监测中心。 本标准主要起草人 ： 李春生、 米振杰、 李云、刘静静、赵义良、 杜顺丰、 吴萌、 王振来、张静 。 DB13/T 2894 20

2、18 1 动物尿液 中苯乙 醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物尿液中 苯乙醇胺 A的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设备、 样品 处理、测定 、 结果计算 、检出限 、准确度、精密度 、 确证试验等要求。 本标准适用于 动物尿液 中苯乙醇胺 A的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法 GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则 NY/T 3146 动物尿

3、液中 22种 -受体激动剂的测定 液相色谱 -串联质谱法 3 原理 采用酶联免疫吸附法，在微孔条上包被偶联抗原， 样本 中的苯乙醇胺 A与酶标板上的偶联抗原竞争 苯乙醇胺 A抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在 450 nm处测定吸光度， 吸光度值与苯乙醇胺 A含量成负相关，与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺 A含量。 4 试剂和材料 以下所有的试剂， 除 特别注明外 均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的二级水。 4.1 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒 ： 应 符合 GB/T 33411 的 规定 ， 组成 见附录 A。 4.2 乙酸铵。 4.3 乙酸。 4

4、.4 氢氧化钠。 4.5 乙酸乙酯 。 4.6 氯化钠 。 4.7 -盐酸葡萄糖醛苷酶 。 4.8 芳基硫酸酯酶 。 4.9 苯乙醇胺 A 标准品。 DB13/T 2894 2018 2 4.10 乙酸铵缓冲液 (2 mol/L) ：称取乙酸铵 15.4 g，溶解于 1000 mL 水中，用适量乙酸调 pH 至 5.2。 4.11 氢氧化钠 溶液 (5 mol/L)：称取氢氧化钠 2 g，溶解于 10 mL 水中。 4.12 -盐酸葡萄糖醛苷酶 /芳基硫酸酯酶： -盐酸葡萄糖醛苷酶活性约 30 U/mL；芳基硫酸酯酶活 性约 60 U/mL。 5 仪器和设备 5.1 分析天平：感量 0.1 g

5、。 5.2 酶标仪： 配备 450 nm 滤光片。 5.3 离心机： 10 000 rpm。 5.4 旋涡混合器。 5.5 恒温箱。 5.6 电热恒温振荡水槽。 5.7 氮吹仪。 5.8 pH 计。 5.9 微量移液器： 50 L， 100 L， 200 L， 1 000 L。 5.10 八 道移液器 ： 250 L。 6 样品处理 6.1 样品 制备 动物 尿液 试样使用前放置室温，如有混浊，离心后取上清 液 备用 ， 4 保存 。 6.2 酶解 准确量取 5.0 mL试样（ 6.1）于 50 mL离心管，加入乙酸铵缓冲液（ 4.10） 0.5 mL，再加入 -盐酸葡 萄糖醛苷酶 /芳基硫酸

6、酯酶（ 4.12） 50 L，旋涡混匀，于 37 下避光水浴振荡 16 h。 6.3 提取 酶解后，用氢氧化钠溶液（ 4.11）调 pH至 9.8 0.2，加入乙酸乙酯（ 4.5） 10 mL，再加入固体氯 化钠（ 4.6） 1.5 g 2 g饱和水相，旋涡混匀， 10 000 rpm离心 5 min，取上清液于另一 50 mL离心管内。 再用乙酸乙酯 10 mL重复提取一次。合并上清液， 50下氮气吹干，用 乙酸铵 溶液（ 4.10） 5 mL溶解。 取 100 L定容液加入 200 L样本稀释液，混匀后备用。 7 测定 7.1 使用前将试剂盒在室温下回温 1 h 2 h，将所需的酶标板条插

7、入板架中。 DB13/T 2894 2018 3 7.2 每孔依次加标准品或 试样 50 L，再加抗体 工作液 50 L，轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板，置 37 下反应 45 min。 7.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，完全除去孔中的液体，每孔加 250 L 洗涤液， 5 s 后倒掉孔中液体，拍干，重复洗涤三遍。 7.4 每孔加酶标记抗体工作液 100 L。用盖板膜盖板，置 37 下反应 30 min，重复 7.3。 7.5 底物液 A 液和 B 液按体积比 1 1 混匀后，每孔加 100 L， 37 下避光显色 15 min。 7.6 每孔加终止液 50 L，轻轻振荡混匀，放入

8、酶标仪， 450 nm 波长测定吸光度值。 8 结果计算 按公式（ 1）计算 百分吸光度比值 ： %1000 BBY （ 1） 式中： Y 百分吸光度比值； B 标准溶液 或试样 溶液的 平均 吸光度值； B0 空白（ 零 浓度的标准溶液）的 平均 吸光度值。 以百分吸光度比值为纵坐标，以苯乙醇胺 A标准品浓度（ g/L）的对数（ lg）为横坐标，绘制标 准曲线。将 试样 的百分吸光度比值代入标准曲线，计算出溶液的浓度， 试样 中苯乙醇胺 A的浓度（ g/L） 按照公式（ 2）计算 。 VNcVX 1 （ 2） 式中： X 试样中的苯乙醇胺 A的含量，单位为微克每升（ g/L）； c 从标准曲

9、线上得到的待测溶液中苯乙醇胺 A的浓度，单位为微克每升（ g/L）； V1 试样提取溶液体积，单位为毫升（ mL）； N 试样稀释倍数； V 试样的体积，单位为毫升（ mL）。 9 检出限、准确度、精密度 9.1 检出限 本方法的检 出 限为 0.2 g/L。 9.2 准确度 本方法在 0.2 g/L 2 g/L添加浓度水平上的回收率为 80 % 120 %。 9.3 精密度 本方法在 0.2 g/L 2 g/L浓度范围的添加回收实验，批内变异系数应 20 %。 DB13/T 2894 2018 4 10 确证试验 如被测样品中检出苯乙醇胺 A时，需要用质谱方法进行确证 。 DB13/T 2894 2018 5 附 录 A （资料性附录） 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒组成 A.1 酶标板：规格为 12 条 8 孔。 A.2 苯乙醇胺 A 系列标准溶液： 0 g/L、 0.1 g/L、 0.3 g/L、 0.9 g/L、 2.7 g/L、 8.1 g/L。 A.3 抗体工作液 。 A.4 酶标记抗体工作液 。 A.5 浓缩 样本 稀释液 ：使用前按说明书配制。 A.6 浓缩洗涤液 ：使用前按说明书配制。 A.7 底物液 A 液。 A.8 底物液 B 液。 A.9 终止液。