DB14808—2013 羊人工授精技术规程.pdf

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1、ICS65.020.30B 43DB14地方标准DB 14/8082013羊人工授精技术规程2013-12-20 发布2014-01-20 实施山西省质量技术监督局发 布DB14/8082013I目 次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14材料及人员装备.25场所建设.26采精公羊的准备.27母羊发情鉴别.38采精.39精液品质检查.310精液稀释.411精液的分装、保存和运输.512输精.513输精后母羊的管理.6附录 A（规范性附录）试剂、药品及动物产品.7附录 B（规范性附录）羊人工授精主要仪器、器具及用品.8附录 C（规范性附录）器具洗涤与灭菌.9附录 D（规范性附

2、录）各种溶液配制及灭菌.11附录 E（资料性附录）羊人工授精记录表.12DB14/XXXXX2013II前 言本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。本标准由山西省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：山西省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：毛杨毅、罗惠娣、李俊、赵鹏、王志武、张冠武、李希、郭慧慧、郭宏宇、吴苏君、李春艳。DB14/80820131羊人工授精技术规程1范围本标准规定了羊人工授精的术语和定义、材料及人员装备、场所建设、采精公羊的准备、母羊发情鉴别、采精、精液品质检查、精液稀释、精液的分装保存和运输、输精及输精后母羊的管理等。本标准适用于山西省境内羊的人工授

3、精。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB 20557山羊冷冻精液3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1羊人工授精借助于专用器具，用人工方法将种公羊的精液采出，经质量检查和处理后，再用输精器将合格精液输入到发情母羊的生殖道内，由人工完成配种过程的一种繁殖技术。3.2试情公羊专门用于寻找发情母羊而不参加配种的公羊。试情公羊一般采取带试情布或输卵管结扎、阴茎移位手术的方法防止其配种。3.3台羊采精时用于种公羊爬跨的发情母羊或人工制作的假羊。3.4假阴道

4、由硬橡胶外壳、柔软橡胶内胎和带夹层玻璃集精杯组装成的圆筒状采精器具，替代母羊阴道。DB14/XXXXX201323.5采精借助于专门器具,人工采集种公羊精液的过程。3.6输精用输精器械将精液输入发情母羊的子宫颈口或阴道内，使其受孕。4材料及人员装备人工授精所用的试剂、仪器设备、器具及器具洗涤灭菌、溶液配制及灭菌应符合附录A、附录B、附录C、附录D，记录表见附录E。采精、精液处理、输精等人员手臂清洗消毒后穿工作服，戴一次性口罩、灭菌手套及工作帽。5场所建设5.1场所设置人工授精场所包括采精室、精液品质检查室、输精室、种公羊圈、待配母羊圈和已配母羊圈。5.2场所要求采精室15 m218 m2，设有

5、采精架；精液品质检查室10 m2；配种室15 m218 m2，设有输精架。三室依次相邻，公羊圈与采精室相连，待配母羊圈和已配母羊圈与输精室相连。室内要求宽敞、明亮、安静、卫生，地面需硬化、防滑，消毒方法按附录C执行。精液品质检查室室温在2530，配备必要的仪器设备、试剂、操作台及紫外线杀菌灯等。6采精公羊的准备6.1公羊选择品种优良、系谱档案完整、检疫合格，且个体体质健壮、生产性能良好、性欲旺盛及精液品质好，与受配母羊无亲缘关系。6.2饲养管理提供营养平衡的日粮，公羊保持中上等膘情，自由饮水，适当增加运动量。6.3采精训练公羊在配种前一个月开始采精训练。成年公羊熟悉采精环境、形成条件反射，并排

6、出死精和退化精子。初次采精的公羊让其观摩成年公羊的配种，或放在发情母羊群直接交配，然后逐步实施人工采精。6.4采精前准备DB14/80820133公羊进入采精室前用湿毛巾将阴茎的包皮周围擦拭干净。7母羊发情鉴别7.1试情公羊鉴别在配种期，每天早晨、下午分别将试情公羊放入母羊群1h左右，试情公羊与母羊的比例是1:30。当母羊向公羊靠拢，公羊追逐时母羊站立不动，愿意接受公羊爬跨，可确定母羊发情。7.2外阴鉴别母羊外阴湿润、微红肿，且表现出爬跨其它母羊的行为，可确定其发情。7.3阴道鉴别用开膣器打开阴道，观察阴道和子宫颈口的情况，若子宫颈口松弛开张、充血、发红以及阴道松弛、充血并有粘液时，可确认其发

7、情。对鉴别出的发情母羊做好标记和记录，并及时配种。8采精8.1假阴道安装与准备将内胎装入外壳内，并用橡皮圈固定。用酒精消毒假阴道后将集精杯固定于一端。通过假阴道外壳上注水孔，加入50左右的热水150 mL180 mL，调试其温度为4042。用玻璃棒将医用凡士林均匀涂抹于假阴道口部内胎至1/2处，通过注水孔上的调节钮向夹层吹气，使假阴道采精口端内胎呈“”形状。8.2采精采精前将台羊尾部擦拭干净，采精人员蹲在台羊右后方，右手横握假阴道，食指顶住集精杯，活塞在下，使假阴道前低后高，并与地面呈3540角紧靠母羊臀部。当公羊爬跨伸出阴茎时，左手轻托公羊包皮，将阴茎导入假阴道内，公羊猛力前冲并弓腰后，则完

8、成射精。当公羊从母羊身上滑下时，顺势将假阴道向下向后移动取下，并立即倒转竖立，使集精瓶一端在下。打开气嘴排除空气，取下集精杯，盖上盖，立即送精液品质检查室。8.3采精频率种公羊一般每周采精45 d，采精2 d后休息1 d。每天可采精12 次，必要时可根据公羊的体力和精液品质情况增加到23 次。若1 d采精2 次，一般是上、下午各1 次，也可连续采精2 次，但间隔时间不少于30 min。9精液品质检查9.1射精量成年公羊的射精量为0.5 mL2 mL，平均为1 mL。当射精量减少或性欲减退时应让公羊休息12 d后再采精。DB14/XXXXX201349.2气味正常的精液略有腥味。凡有异味者，应废

9、弃。9.3颜色正常的精液为乳白色。凡呈灰、黄、红和绿色或有絮状物者，应废弃。9.4状态精液中精子的密度大、活力高，精子运动使精液翻腾呈现漩涡云雾状。9.5精子活力室温2530，取1 滴稀释精液置于37左右载玻片上，上覆盖玻片，在400600 倍生物显微镜下观察精子活力。用于人工授精的精子活力应在0.8以上，精子活力评分方法见表1。表 1精子活力评分表直线运动精子（%）100908070605040302010精子活力评分1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.19.6精子密度精子密度检查采用原精液，检查方法与精子活力检查方法相同。但精子密度分为“密”、“中”、“稀”三级。“密

10、在显微镜观察的视野中，精子之间几乎无间隙，每毫升精液中精子在30 亿以上；“中”，精子间隙相当一个精子长度，每毫升精液中精子在20 亿以上；“稀”，精子间隙超过一个精子长度，每毫升精液中精子在15 亿左右。在有条件的情况下可使用血细胞计算板方法测定精子数量。10精液稀释10.1要求精液采出后应尽快稀释，稀释操作在精液品质检查室进行。稀释后确保0.1 mL精液中有效精子数在7 500万个以上。10.2稀释液10.2.1生理盐水稀释液（稀释剂）生理盐水稀释后的精液只能做现场输精用。一般稀释12 倍。10.2.2牛奶、羊奶稀释液（营养剂）新鲜牛奶或新鲜羊奶作为精液稀释液，一般稀释35 倍。10.

11、2.3葡萄糖、柠檬酸钠稀释液（营养剂）一般稀释35 倍。10.3稀释方法DB14/80820135将精液和稀释液同时置于30左右的水浴锅或恒温箱中作片刻同温处理。用注射器或带刻度的吸管将稀释液沿集精杯壁缓缓注入精液中，稀释过程中要防止精子受到剧烈冲击、温度骤变和其他有害因素的影响。进行高倍稀释时，先进行低倍稀释，数分钟后再进行二次稀释。11精液的分装、保存和运输11.1分装为便于将精液分送到其它配种点，将稀释好的精液分装到2 mL5 mL Eppendorf 管中，每管按1020个输精剂量进行分装，或用塑料细管按每头份输精剂量进行分装。标注公羊号、采精日期、精液剂量、稀释倍数、精子活力、密度和

12、输精量等。11.2保存11.2.1常温保存对采取的新鲜精液经稀释后，现场进行人工授精时可常温下短期保存。11.2.2低温保存将盛稀释精液的管置于冰箱内，在05的低温状态下可保存24 h左右。使用前应升至常温。11.3运输低温保存精液要采用保温瓶（盒）进行运输，在运输途中应避光、防震。12输精12.1精液来源用于人工输精的精液有鲜精和冷冻精液。12.2输精前准备12.2.1冷冻精液解冻颗粒冷冻精液解冻法：将0.2 mL的2.9%柠檬酸钠解冻液加入试管内湿润管壁后倒出，然后将试管放入水温3842的水浴锅中，从液氮罐中取出颗粒冻精12 粒迅速投入试管摇动至融化，立即取出置室温待用。细管精液解冻法：取

13、细管1支，置于3842水浴锅中轻摇8 s左右，取出至融化。冷冻精液解冻后精子活力达到0.4以上才可用于输精。12.2.2母羊保定与准备输精架保定：在地面相距1 m2 m栽立两根木柱，距地面0.8 m1 m左右两根木柱间架一横杆，将输精母羊的后肢（肷部）架在横杠上悬空，前肢着地，数只发情母羊可同时架在横杠上。人工保定：保定人员背靠墙壁骑在母羊脖子上，双手抓住发情母羊后腿将母羊提起倒立，前肢着地，母羊腹部朝向输精人员，母羊倒立高度以输精人员能方便输精为宜。母羊保定后由专人揭开母羊尾巴，将母羊会阴部及周围擦洗干净，等待输精。DB14/XXXXX2013612.3输精12.3.1输精方法输精人员左手持

14、用生理盐水温润过的开膣器（闭合状态），将开膣器沿母羊阴门形状的方向慢慢插入阴道，然后轻轻转动90打开开膣器，在阴道底部寻找子宫颈口。发情母羊的阴道及子宫颈口充血，子宫颈口松弛、开张，颜色较阴道壁色暗，容易寻找。输精员右手持输精器，将输精器轻轻插入羊子宫颈口内0.5 cm1.0 cm，按输精量把精液输入子宫颈口内。由于个别处女羊阴道比较紧，开膣器无法插入，可采用阴道输精法输精，输精量加大1倍。输精完毕将母羊后腿轻轻放下，防止精液倒流出。输精量：原精液0.0 5mL0.1 mL，稀释后精液0.1 mL0.2 mL。确保每次输入有效精子数在7 500万个以上。12.3.2输精次数母羊发情后进行第一次

15、输精，间隔6 h8 h进行第二次输精，若第二天仍发情进行第三次输精。13输精后母羊的管理输精后母羊统一按妊娠母羊进行管理。但要注意观察其输精后2 个发情周期内是否发情，若发情，应及时配种。DB14/80820137AA附录A（规范性附录）试剂、药品及动物产品葡萄糖、柠檬酸钠、EDTA、青霉素、链霉素、新鲜羊奶、新鲜牛奶、卵黄、生理盐水、盐酸、0.1%新洁尔灭、碘酒、70%75%酒精等，各种化学试剂均为分析纯，动物产品及抗生素应符合细胞培养要求，药品均在有效期内。DB14/XXXXX20138BB附录B（规范性附录）羊人工授精主要仪器、器具及用品羊人工授精主要仪器、器具及用品见B.1表。表 B.

16、1羊人工授精主要仪器、器具及用品表名称数量名称数量集精杯10 个广口瓶（500 ml）5 个假阴道外壳5 个移液器1 套假阴道内胎15 个刻度吸管（2 mL、5 mL、10 mL）各 5 个输精量调节器6 个刻度试管（1 mL、2 mL、5 mL、10 mL）各 10 个400600 倍显微镜1 台注射器（1 mL、2 mL、5 mL、10 mL）各 10 个盖玻片、载玻片各 2 盒Eppendorf 管（2 mL、5 mL）各 1 包擦镜纸1 本脱脂纱布2 包羊输精器20 套脱脂药棉2 包开膣器20 个镊子（20 cm,30 cm）4 把电冰箱1 台医用剪刀2 把天平（千分之一）1 台玻璃棒

17、4 根蒸馏水仪1 台100温度计5 支高压灭菌锅、普通灭菌锅各 1 个酒精灯2 个干燥箱1 台医用白凡士林1 瓶恒温箱1 台滤纸5 盒水浴锅1 个毛刷5 把器械箱2 个记号笔、标签笔各 3 支液氮罐1 个标签100 个药品柜1 个试情布10 条紫外线灯6 个手电筒2 把热水壶1 个脸盆4 个电暖器或火炉3 个毛巾10 条条形桌、椅2 套食用碱面500 克医用方盘（不锈钢或搪瓷盘）2 个肥皂3 块广口保温瓶2 个纸巾5 包暖水瓶2 个记录本1 个剪毛剪2 把工作服10 套烧杯（500 mL、250 mL、100 mL）各 2 个一次性口罩、PE 手套、工作帽各 3 包量筒（25 mL、50 mL

18、100 mL）各 2 个动物精子密度测定仪1 台定量瓶（50 mL、100 mL）各 2 个精液细管及封口机1000 支、1 台试剂瓶（50 mL、100 mL、500 mL）各 10 个无菌操作台1 台DB14/80820139CC附录C（规范性附录）器具洗涤与灭菌C.1器具洗涤C.1.1浸泡新购置的玻璃器皿使用前应先用自来水刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡12 h以上。使用后的玻璃器皿立即浸入清水中。C.1.2刷洗浸泡后玻璃器皿在洗涤剂水中用毛刷洗刷，洗刷时要防死角，或者在超声波清洗仪的洗涤剂水中洗涤20 min30 min。金属器械在洗涤剂水中刷洗干净C.1.3冲洗刷洗的玻璃器皿和金属器

19、械用自来水反复冲洗，直至洗涤剂冲洗干净，然后用蒸馏水涮洗23 次，晾干备用。C.1.4假阴道洗涤采精结束后首先用40左右1碳酸钠水洗涤假阴道内部的油脂，再用温水冲洗干净，然后用蒸馏水涮洗2 次，晾干备用。C.1.5其他经消毒灭菌、密封包装一次性使用的塑料器皿和塑料注射器，打开包装即可使用。C.2采精室、精液品质检查室、输精室及器具消毒灭菌C.2.1紫外线灭菌法采精室、精液品质检查室、输精室、操作台表面、工作服、塑料器皿和一些不能使用其它方法进行消毒灭菌的物品采用紫外线消毒灭菌。塑料制品放在距紫外线灯50 cm80 cm处，使每平方米厘米有0.06 w能量的照射。紫外线灯照射时间30 min40

20、 min。C.2.2干热灭菌法耐高温的玻璃和金属器具，包装好后放入烘干箱内，160处理40 min60 min，待恢复常温取出。C.2.3高压、湿热灭菌法适用于玻璃器皿、金属器具以及耐压耐热的塑料制品，包装好后放入高压灭菌器内，120（0.105Mpa）灭菌15 min20 min。C.2.4酒精消毒灭菌法DB14/XXXXX201310使用前假阴道内胎用75%酒精擦拭，待15 min20 min酒精挥发后用生理盐水冲洗23 次后倒立，使假阴道内的水分沥干净即可使用。DB14/808201311DD附录D（规范性附录）各种溶液配制及灭菌D.1精液稀释液配制及灭菌D.1.1新鲜羊奶、新鲜牛奶稀释

21、液新鲜牛奶或羊奶用数层纱布过滤后加热至9295，维持10 min，然后冷却至室温，除去奶皮。100 ml奶里加入青霉素10万国际单位、链霉素0.1 g，充分摇匀，4保存待用。D.1.2葡萄糖、柠檬酸钠稀释液称葡萄糖3 g、柠檬酸钠1.4 g、EDTA 0.1 g置于烧杯中，加约80 mL蒸馏水，充分搅拌溶解。然后加蒸馏水定容至100 mL，高温（120）高压（0.105Mpa）灭菌15 min20 min,冷却至室温。再加入新鲜卵黄10 mL、青霉素10万国际单位、链霉素0.1 g，充分摇匀，4保存待用。D.1.3生理盐水稀释液0.9%医用生理盐水作稀释液。D.2冻精解冻液配制及灭菌称柠檬酸钠2.9 g置于烧杯中，加约80 mL蒸馏水，充分搅拌溶解。然后加蒸馏水定容至100 mL，高温（120）高压（0.105Mpa）灭菌15 min20 min,冷却至室温，4保存待用。DB14/XXXXX201312EE附录E（资料性附录）羊人工授精记录表羊人工授精记录表见E.1表。表 E.1羊人工授精记录表种公羊采精情况采精日期公羊品种耳号年龄采精量密度活力稀释液稀释倍数备注母羊配种情况配种日期公羊品种、耳号鲜精/冻精原精液/稀释精液精子密度、活力母羊品种、耳号第一次/输精量第二次/输精量第三次/输精量备注采精人：输精人：精液品质检查人：精液处理人：人工授精参加人员：地点：_