DB36 T 1904-2023 实验动物 支原体荧光定量PCR检测方法.pdf

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1、ICS 65.020.30 CCS B 44 DB36 江西省地方标准 DB36/T 19042023 实验动物 支原体荧光定量 PCR 检测方法 Laboratory animalreal-time quantitative PCR method for examination of mycoplasma 2023-12-11 发布 2024-06 01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 19042023 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.2 5 设备和材料.2 6 试剂.2 7 检测流程.2 8 结果判定.4 附

2、录 A（规范性附录）溶液配制方法.5 附录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针.7 附录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法.8 参 考 文 献.9 DB36/T 19042023 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：肖芳平、张陆兵、周银平、熊莉娟、万筱荣、贾菠、刘欢、罗勇兵、谢金明、周剑、李银才。DB36/T 19042

3、023 1 实验动物 支原体荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物支原体荧光定量PCR检测的术语和定义、缩略语、设备和材料、试剂、检测流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠、大鼠中支原体的检测，饲养环境中支原体的检测参照执行。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922 实验动物 微生物、寄生虫学等级及监测 GB 19489 实验室 生物安全通用要求

4、GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 39760 实验动物 安乐死指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 支原体 mycoplasma 支原体属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，大小介于病毒和细菌之间，约0.1m 0.6m，没有细胞壁，仅有三层结构且富含胆固醇的细胞膜。大多数的支原体都具有种属特异性。3.2 荧光定量聚合酶链式反应 real-time quantitative polymerase chain reaction;real-time PCR 在常规PCR的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告

5、荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.3 Ct 值 cycle threshold value DB36/T 19042023 2 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)；PBS：磷酸盐

6、缓冲液(phosphate buffered saline)；Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)；5 设备和材料 5.1 设备 设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织匀浆器、生物安全柜、超净工作台、冰箱（4、-20、-80）、微量移液器（0.2 L2 L、2 L20 L、20 L200 L、100 L1000 L）。5.2 材料 灭菌离心管（0.2 mL、1.5 mL、5 mL、15 mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。6 试剂 6.1 本文件所用试剂均为分析

7、纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。6.2 灭菌 PBS（配制方法见附录 A 中 A.1）。6.3 裂解液（配制方法见附录 A 中 A.5）。6.4 蛋白酶 K（配制方法见附录 A 中 A.6）。6.5 乙酸钾溶液（配制方法见附录 A 中 A.7）。6.6 Tris-饱和酚：pH7.8。6.7 氯仿/异戊醇(241)：将氯仿和异戊醇按照体积比 241 的比例配制。6.8 无水乙醇：-20 预冷。6.9 70%乙醇（配制方法见附录 A 中 A.8）。6.10 TE 缓冲液（配制方法见附录 A 中 A.9）。6.11 DNA 抽提试剂盒:商品化试剂盒。6.12 荧光定量 PCR

8、 试剂盒：商品化试剂盒。6.13 引物与探针（见附录 B 中 B.1）。6.14 阳性对照：支原体 DNA。6.15 阴性对照：不含支原体 DNA。7 检测流程 7.1 生物安全要求 DB36/T 19042023 3 实验操作及处理按照GB 19489的规定执行。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2中的要求执行。采样参照GB 14922中的要求执行。7.2 样本采集 7.2.1 脏器组织 按照GB/T 39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的鼻咽部组织、气管组织或肺脏，剪取待检样本2.0 g于无菌15 mL离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 实验动物垫料

9、取1.0 g实验动物垫料置于15 mL离心管中，密封、编号，待检。7.2.3 实验动物设施设备 用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15 mL离心管中，密封、编号，待检。7.3 样本处理 7.3.1 脏器组织 在生物安全柜内用灭菌剪刀将脏器组织剪碎后，加入4 mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆2 min，编号备用。7.3.2 实验动物垫料和实验动物设施设备 向装有样品的离心管中加入4 mL灭菌PBS（垫料或棉拭子需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡10 min，充分混匀，静置30 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。7.4 样本存放 采集

10、或处理的样本在2 8 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置于-80 冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本 DNA 提取 7.5.1 样本 DNA 提取步骤如下：a)取 350L 已处理好的样品加入 350 L 裂解液，然后加入 30 L 的蛋白酶 K 溶液，混匀，56 水浴 2 h 或 37 消化过夜；b)向消化后的裂解液中加入 70L 乙酸钾溶液，混匀冰浴 10 min，4，12000 g 离心 10 min，取上清液转移至新的 1.5 mL 离心管；c)加入等体积的 Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀 10 min，4，12000 g 离心 10 min；d)取上清液至新的离心管中

11、，加入 0.5 倍体积的 Tris-饱和酚和 0.5 倍体积的氯仿/异戊醇（241），12000 g 离心 10 min；e)取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（241），12000 g 离心 10 min；f)取上清液至新的离心管中，加入 2 倍体积-20 预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12000 g 离心 10 min，弃上清；g)加入 500 L 70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，12000 g 离心 3 min，吸去上清液；DB36/T 19042023 4 h)室温下放置 2 min 使残余乙醇完全挥发，加入 100 L TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀，即可用于检

12、测或-20 保存备用。7.5.2 样本 DNA 也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6 荧光定量 PCR 检测 荧光定量PCR检测应符合附录C。8 结果判定 8.1 质控标准 阳性对照 Ct 值35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无 Ct 值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定 符合 8.1 条件下，被检样本 Ct 值35，且出现对数扩增曲线，判定为阳性；被检样本无 Ct 值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本 35Ct 值40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴

13、性。DB36/T 19042023 5 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制方法 A.1 灭菌 PBS 溶液 准确称取氯化钠（NaCl）8.00 g，氯化钾（KCl）0.20 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24 g，磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）3.65 g，先加入800 mL去离子水溶解，调节溶液pH至7.2 7.4，定容至1000 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min，冷却备用。A.2 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入80 mL水中，充分搅拌，用氢氧化钠（NaOH）颗粒调p

14、H至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121)条件下灭菌20 min。A.3 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解于800 mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。A.4 5 mol/L 氯化钠溶液 称取29.22 g氯化钠（NaCl）溶于80 mL水中，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。A.5 裂解液 在约700 mL水中，依次加入10 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二

15、钠溶液、20 mL 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、80 mL 5 mol/L氯化钠溶液。另称取10 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa，SDS），混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至1000 mL，室温保存备用。A.6 蛋白酶 K 溶液 将20 mg蛋白酶K（20U/mg）溶于9.5 mL水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至10 mL。于-20 保存备用。A.7 乙酸钾溶液（pH 4.8）称取29.43 g乙酸钾（KAc）溶于60mL水，用冰乙酸（HAc）调pH至4.8，加水定容至100 mL。在103.4kPa（121）条件下灭菌20 min。DB36/T 19042

16、023 6 A.8 70%乙醇 取70mL无水乙醇，加入蒸馏水30mL，充分混匀后备用。A.9 TE 缓冲液（pH 8.0）在约800 mL水中，依次加入10 mL 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和2 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121）条件下灭菌20 min。DB36/T 19042023 7 B B 附 录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针 B.1 引物与探针序列 正向引物 5-ATGGAGTGACACAGCGTGCA-3 反向引物 5-GGATAACGCTTGCRACCT

17、ATGTAT-3 探针 FAM-CCGCGGCTGCTGGCACATAGTT-BHQ-1 注：探针可选用具有与FAM和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。DB36/T 19042023 8 C C 附 录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法 C.1 荧光定量PCR反应体系 反应液的配制应在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。以支原体DNA作阳性对照、不含支原体的DNA作阴性对照、以灭菌去离子水作空白对照。表C.1 每个荧光定量 PCR 反应体系 反应组分 用量 终浓度 2 mix 10L 1 正向引物（10mol/L）0.8L 400nmol

18、/L 反向引物（10mol/L）0.8L 400nmol/L 探针（10mol/L）0.4L 200nmol/L DNA 模板 2L-灭菌去离子水 6L-总体积 20L-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。C.2 荧光定量PCR反应条件 表C.2 荧光定量 PCR 反应条件 步骤 温度 时间 采集荧光信号 循环数 预变性 95 2min-1 变性 95 10s-40 退火 60 30s-延伸 72 30s 是 注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T 19042023 9 参 考 文 献 1 辛闻婷,杨媛媛,王馨宇,等.实验动物常见支原体荧光定量

19、PCR检测方法建立J.实验动物科学2019,36(05):60-65 2 章凌,吕国贞,邹勇,等.上海市卫生系统实验大小鼠常见病原菌调查J.中国实验动物学杂志,1991(02):66 3 Cahill J F,Cole B C,Wiley B B,et al.Role of Biological Mimicry in the Pathogenesis of Rat Arthritis Induced by Mycoplasma arthritidisJ.Infection&Immunity,1971,3(1):24-35 4 Schoeb T R,Dybvig K,Keisling K F,et al.Detection of mycoplasma pulmonis in cilia associated respiratory bacillus isolates and in respiratory tracts of rats by nested PCR J.J Clin Microbiol,1997,35(7):16671670 5 傅军,吴亦栋,余钟声.支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR法检测鼠支原体感染试验J浙江畜牧兽医,2011(2):12 _