DB5301 T 67-2021 马铃薯脱毒组培苗繁育技术规程.pdf

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1、I C S 6 5.0 2 0.2 0C C S B 2 3DB5301昆 明 市 地 方 标 准D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 1马 铃 薯 脱 毒 组 培 苗 繁 育 技 术 规 程2 0 2 1-1 2-3 1 发 布 2 0 2 2-0 1-0 1 实 施昆 明 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 1I目 次前 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 组 培 室 的 要 求.24.1 组 培 室 布 局.24.2 设 施、设 备 及 药 品.34.3 培 养 基 配 方.

2、34.4 卫 生 要 求.35 脱 毒 材 料 的 选 取.45.1 植 株 初 选.45.2 材 料 选 择.45.3 类 病 毒 筛 查.46 脱 毒 与 培 养.46.1 外 植 体 材 料 预 处 理.46.2 无 菌 苗 培 养 基 的 制 备.46.3 外 植 体 消 毒.46.4 离 体 培 养 无 菌 苗.56.5 茎 尖 培 养 基 的 制 备.56.6 茎 尖 剥 离 与 接 种.56.7 茎 尖 培 养.57 病 毒 检 测 和 品 种 真 实 性 鉴 定.57.1 病 毒 检 测.57.2 品 种 真 实 性 鉴 定.68 核 心 苗 保 存 与 基 础 苗 培 养.6

3、8.1 操 作 步 骤.68.2 培 养 条 件.69 组 培 苗 扩 繁.69.1 基 础 苗 复 检.69.2 培 养 基 制 备.69.3 无 菌 接 种.79.4 扩 繁.79.5 瓶 苗 培 养.7D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 1I I附 录 A（规 范 性）组 培 设 施、设 备 及 药 品.8附 录 B（规 范 性）M S 培 养 基 配 方 和 母 液 配 制 要 求.1 0附 录 C（规 范 性）无 菌 苗 培 养 基 配 方.1 2附 录 D（规 范 性）茎 尖 培 养 基 配 方.1 3附 录 E（规 范 性）脱 毒 苗 扩 繁 培 养 基 配 方.1

4、4附 录 F（规 范 性）核 心 苗 保 存 培 养 基 配 方.1 5D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规定 起 草。本 文 件 由 昆 明 市 农 业 农 村 局 归 口。本 文 件 起 草 单 位:昆 明 市 农 业 科 学 研 究 院、云 南 师 范 大 学 马 铃 薯 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人:张 丽 芳、蒋 瑜、朱 维 贤、邹 万 君、杨 春 利、李 灿 辉、刘 卫 民、

5、施 林、李 荣琼、李 华、李 昌 远、王 薇、储 丽 章、迟 静 娣、杨 永 东、汪 忠 明。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 11马 铃 薯 脱 毒 组 培 苗 繁 育 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 组 培 室 的 要 求，脱 毒 材 料 的 选 取、无 菌 苗 培 养、茎 尖 脱 毒 与 培 养、病 毒 和 品 种 真实 性 鉴 定 及 组 培 苗 扩 繁 等 技 术 操 作 规 程。本 文 件 适 用 于 马 铃 薯 脱 毒 和 脱 毒 组 培 苗 的 扩 繁。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引

6、 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2 马 铃 薯 脱 毒 试 管 苗 繁 育 技 术 规 程G B/T 2 9 3 7 8 2 0 1 2 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 生 产 技 术 规 程N Y/T 4 0 1 2 0 0 0 脱 毒 马 铃 薯 种 薯（苗）病 毒 检 测 技 术 规 程N Y/T 1 9 6 3-2

7、 0 1 0 马 铃 薯 品 种 鉴 定3 术 语 和 定 义G B/T 2 9 3 7 5-2 0 1 2 界 定 的 与 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件，为 了 便 于 使 用，以 下 重 复 列 出 了 G B/T2 9 3 7 5-2 0 1 2 的 部 分 术 语 和 定 义。3.1脱 毒应 用 茎 尖 分 生 组 织 培 养 技 术，脱 去 主 要 危 害 马 铃 薯 的 病 毒 和 类 病 毒。3.2叶 原 基在 茎 尖 生 长 点 的 基 部 形 成 的 突 起。来 源：G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2，3.1 3.3茎 尖芽 顶 端 部 分（

8、0.1 m m 1 0 m m）其 中 包 括 分 生 组 织（0.0 5 m m 0.1 m m）及 芽 原 基 和 正 在 生 长 发育 的 叶 原 基。来 源：G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2，3.2 3.4茎 尖 分 生 组 织茎 部 位 具 有 持 续 或 周 期 性 分 裂 能 力 的 细 胞 群。来 源：G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2，3.3 3.5D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 12离 体 培 养从 植 物 体 分 离 出 符 合 需 要 的 器 官、组 织、细 胞、原 生 质 体 等，通 过 无 菌 操 作，在 人 工 控 制 条

9、 件下 进 行 培 养 以 获 得 再 生 的 完 整 植 株 或 生 产 具 有 经 济 价 值 的 其 它 产 品 的 技 术。来 源：G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2，3.4 3.6外 植 体指 从 生 长 健 壮 无 病 虫 害 的 植 株 上 取 下 用 作 离 体 培 养 材 料 的 器 官 或 组 织 的 片 段。3.7无 菌 苗指 在 无 菌 条 件 下，将 马 铃 薯 块 茎 芽 或 者 大 田 马 铃 薯 健 康 植 株 上 的 顶 芽、腋 芽 或 茎 段 按 外 植 体 的消 毒 流 程 进 行 严 格 的 消 毒 后，接 种 在 M S 培 养 基 或 加

10、 激 素 的 M S 培 养 基 上，在 人 工 控 制 条 件 下 培 养 获 得的 无 菌 完 整 植 株。3.8脱 毒 核 心 苗应 用 茎 尖 分 生 组 织 培 养 技 术 获 得 的，经 检 测 确 认 不 带 马 铃 薯 卷 叶 病 毒（P L R V）、马 铃 薯 Y 病 毒（P V Y）、马 铃 薯 A 病 毒（P V A）、马 铃 薯 X 病 毒（P V X）、马 铃 薯 M 病 毒（P V M）、马 铃 薯 S 病 毒（P V S）等 病 毒 和 马 铃 薯 纺 锤 块 茎 类 病 毒（P S T V D）、不 带 任 何 细 菌 和 真 菌，经 试 种 观 察 具 有

11、原 品 种 典 型 性状 的 脱 毒 苗。3.9基 础 苗由 核 心 苗 繁 殖 的、经 检 测 无 病 毒 和 类 病 毒 的 脱 毒 苗。4 组 培 室 的 要 求4.1 组 培 室 布 局组 培 室 建 设 时 周 围 应 无 污 染 源，与 大 田 生 产 隔 离，选 择 向 阳、通 风、干 燥、清 洁 的 环 境。应 设置 清 洗 室、配 制 室、灭 菌 室、无 菌 贮 存 室、缓 冲 间、更 衣 室、接 种 室、培 养 室 等 功 能 区，并 应 相 互隔 离。各 功 能 区 布 局 应 遵 循 方 便 消 毒、减 少 污 染 的 原 则。培 养 室 可 采 用 人 工 光 源 和

12、 全 自 然 光 两 种，采 用 全 自 然 光 时，培 养 室 宜 选 用 玻 璃 或 阳 光 板 建 设，配 备 水 帘 和 风 机 等 降 温 设 备，水 帘 外 应 加 挂 6 0 目 网 纱；门 口 要 建 缓 冲 间，缓 冲 间 地 面 应 设 置 消 毒 槽。组 培 室 各 功 能 间 布 局 见 图 1。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 13图 1 组 培 室 各 功 能 间 布 局 平 面 示 意 图4.2 设 施、设 备 及 药 品4.2.1 生 产 组 培 苗 的 设 施、设 备 见 附 录 A。4.2.2 生 产 组 培 苗 的 试 剂 见 附 录 B。4

13、.3 培 养 基 配 方4.3.1 无 菌 苗 培 养 基 配 方 见 附 录 C。4.3.2 茎 尖 培 养 基 配 方 见 附 录 D。4.3.3 脱 毒 苗 扩 繁 培 养 基 配 方 见 附 录 E。4.3.4 核 心 苗 保 存 培 养 基 配 方 见 附 录 F。4.4 卫 生 要 求4.4.1 基 本 要 求。组 培 室 各 功 能 间 应 保 持 干 净、整 洁，每 周 用 0.1%的 优 氯 净 擦 拭 工 作 台 面、窗 台 及拖 地 面。4.4.2 接 种 室。应 定 期 使 用 0.2 5%1%新 吉 尔 灭 擦 拭 窗 台、小 推 车 等，用 0.1%的 优 氯 净

14、擦 拭 地 面，隔天 开 启 紫 外 灯，每 次 4 0 m i n 6 0 m i n。4.4.3 培 养 室。应 定 期 使 用 0.2 5%1%新 吉 尔 灭 擦 拭 培 养 架 和 窗 台，用 0.1%的 优 氯 净 擦 拭 地 面。每 周开 紫 外 灯 1 次 2 次，每 次 4 0 m i n 6 0 m i n。4.4.4 超 净 工 作 台。每 次 使 用 前，应 提 前 打 开 风 机 和 紫 外 灯 3 0 m i n。接 种 时 关 闭 紫 外 灯，用 7 5%酒 精擦 拭 工 作 台 面 及 内 壁。每 周 1 次 2 次 用 0.2 5%1%新 吉 尔 灭 擦 拭 超

15、 净 工 作 台 的 外 表 面。4.4.5 接 种 工 具。每 台 超 净 工 作 台 应 备 两 套 接 种 工 具 轮 流 使 用。接 种 前 对 使 用 的 镊 子、剪 刀、解 剖 刀等 工 具 进 行 灼 烧 或 插 入 高 温 灭 菌 器 中 灭 菌，冷 却 后 使 用。4.4.6 接 种 操 作 人 员。进 入 接 种 室 前，用 肥 皂 或 洗 手 液 洗 净 双 手，换 上 消 毒 工 作 服，戴 好 口 罩。操 作过 程 中，每 转 接 完 一 瓶 基 础 母 瓶 后 用 7 5%的 酒 精 清 擦 手 和 工 作 台 面。4.4.7 消 毒。全 自 然 光 培 养 室 门

16、 口 缓 冲 间 地 面 消 毒 槽 内 应 放 入 消 毒 剂，工 作 人 员 进 入 时 应 对 鞋 底 消 毒。4.4.8 污 染 瓶 苗 的 处 理。组 培 苗 培 养 期 间，经 常 观 察 组 培 苗 的 状 况，发 现 污 染 应 及 时 清 除，污 染 瓶 苗经 高 压 灭 菌 后 再 倒 弃。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 145 脱 毒 材 料 的 选 取5.1 植 株 初 选马 铃 薯 生 育 期 内，在 土 壤 肥 力 中 上 等 的 地 块，于 现 蕾 期 至 开 花 期 选 择 生 长 势 强、具 备 原 品 种 典型 性 状 的 健 康 植 株，做

17、 好 标 记。5.2 材 料 选 择5.2.1 选 用 植 株 进 行 培 养 时，应 选 取 健 康 且 具 备 品 种 典 型 性 状 植 株 的 顶 芽、腋 芽 或 茎 段 作 为 外 植 体 材料。5.2.2 选 用 薯 块 芽 进 行 培 养 时，在 生 育 后 期 到 收 获 期，应 在 已 做 标 记 的 植 株 中 进 行 薯 块 复 选。选 择 高产、大 薯 率 高、无 病 斑、无 虫 蛀、无 机 械 损 伤，且 皮 色、肉 色、薯 形、芽 眼 等 性 状 符 合 品 种 特 征 的 健 康薯，清 洗 泥 土 后 催 芽，作 为 外 植 体 材 料。5.3 类 病 毒 筛 查

18、入 选 的 植 株 或 块 茎，按 照 N Y/T 4 0 1 2 0 0 0 中 附 录 B 给 出 的 方 法 检 测 马 铃 薯 纺 锤 块 茎 类 病 毒（P S T V d），筛 选 无 马 铃 薯 纺 锤 块 茎 类 病 毒（P S T V d）的 块 茎 或 植 株 作 为 培 养 无 菌 苗 的 材 料。6 脱 毒 与 培 养6.1 外 植 体 材 料 预 处 理6.1.1 植 株 处 理将 从 田 间 选 择 的 植 株 移 栽 至 温 室 无 菌 盆 土 中 生 长 一 段 时 间，定 期 喷 洒 杀 菌 剂 于 植 株 上。6.1.2 块 茎 催 芽 和 病 毒 钝 化6

19、.1.2.1 块 茎 自 然 出 芽：入 选 的 块 茎 经 清 洗、消 毒 后 放 置 于 室 内 常 温 下 自 然 萌 发，待 芽 长 至 2 c m 3 c m即 可 用 于 无 菌 苗 的 培 养。对 含 有 S 病 毒、X 病 毒 的 块 茎 需 置 于 3 7 1 培 养 箱 中 处 理 3 周 4 周，钝 化 病 毒。6.1.2.2 人 工 方 法 催 芽：入 选 的 块 茎 经 清 洗 后 用 0.1%硫 脲+5 m g/L 赤 霉 素 溶 液 浸 泡 5 m i n，取 出 晾 干后，用 0.1%多 菌 灵 溶 液 浸 泡 3 0 m i n 或 7 5%酒 精 喷 湿 进

20、 行 表 面 消 毒，置 于 2 5 黑 暗 条 件 下 催 芽，待芽 长 至 2 c m 3 c m 即 可 用 于 无 菌 苗 的 培 养。对 含 有 S 病 毒、X 病 毒 的 块 茎 需 置 于 3 7 1 培 养 箱中 处 理 3 周 4 周，钝 化 病 毒。6.2 无 菌 苗 培 养 基 的 制 备6.2.1 无 菌 苗 培 养 基 可 用 M S 培 养 基 或 加 激 素 的 M S 培 养 基，配 方 参 见 附 录 B 和 附 录 C。6.2.2 将 制 备 好 的 培 养 基 分 装 于 培 养 容 器 中，盖 好 盖 子。6.2.3 将 制 备 好 的 培 养 基 在

21、高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 压 力 为 1.1 k g/c m2、温 度 为 1 2 1 条 件 下 灭 菌 2 5 m i n 3 0m i n，冷 却 后 在 洁 净 贮 存 室 放 置 3 d 5 d 备 用。6.3 外 植 体 消 毒6.3.1 取 材：从 处 理 过 的 块 茎 上 取 2 c m 3 c m 长 的 顶 芽 和 侧 芽，或 取 优 选 植 株 的 顶 芽、腋 芽 或 茎 段 作为 外 植 体 材 料。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 156.3.2 清 洗：在 流 水 下 用 软 毛 刷 轻 轻 逐 个 刷 洗 外 植 体 后 放 于 烧 杯 中，用

22、纱 布 封 口，用 自 来 水 冲 洗1 0 m i n 2 0 m i n。6.3.3 消 毒：在 超 净 工 作 台 上，先 用 7 5%的 酒 精 浸 1 5 s，无 菌 水 冲 洗 2 次，再 用 0.1%的 升 汞 浸 泡 8 m i n 1 0 m i n（或 用 5%次 氯 酸 钠 浸 泡 1 5 m i n 2 0 m i n），无 菌 水 漂 洗 5 次 8 次。6.4 离 体 培 养 无 菌 苗6.4.1 接 种 和 培 养：在 超 净 工 作 台 上，对 经 严 格 消 毒 过 的 块 茎 芽、顶 芽、腋 芽 或 茎 段 等 进 行 剪 切，切除 下 端 药 剂 伤 害

23、的 部 分，接 种 在 M S 培 养 基 或 加 激 素 的 M S 培 养 基 上，在 培 养 容 器 上 注 明 品 种 名 称 和 接 种时 间，放 入 培 养 室 培 养 3 周 4 周。待 芽 长 成 含 4 片 5 片 叶 子 的 小 苗 时，剪 切 成 单 节 段，转 接 于 同 样的 培 养 基 上，培 养 成 苗。同 样 方 法 扩 繁 1 个 2 个 周 期，待 苗 达 一 定 数 量 后，从 无 菌 苗 上 剥 离 茎 尖。6.4.2 培 养 条 件：无 菌 苗 在 温 度 2 0 2 5、相 对 湿 度 7 0%、光 照 强 度 2 0 0 0 L u x 3 0 0

24、 0 L u x 的 条件 下 培 养，光 照 时 数 1 2 h/d。6.5 茎 尖 培 养 基 的 制 备6.5.1 茎 尖 培 养 基 配 方 参 见 附 录 D。6.5.2 将 制 备 好 的 茎 尖 培 养 基 分 装 于 培 养 容 器 中，盖 好 盖 子。6.5.3 将 制 备 好 的 培 养 基 在 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 压 力 为 1.1 k g/c m2、温 度 为 1 2 1 条 件 下 灭 菌 2 5 m i n 3 0m i n，冷 却 后 在 洁 净 贮 存 室 放 置 3 d 5 d 备 用。6.6 茎 尖 剥 离 与 接 种6.6.1 茎 尖 剥 离 与

25、接 种 在 超 净 工 作 台 上 操 作。6.6.2 茎 尖 剥 离 与 接 种 按 下 列 步 骤 进 行：a)在 解 剖 镜 的 载 物 台 上 放 一 张 灭 菌 滤 纸，将 剪 取 的 无 菌 苗 茎 尖 放 置 于 滤 纸 上；b)借 助 4 0 X 双 目 解 剖 镜，剥 离 茎 尖 直 至 露 出 半 圆 形 光 滑 的 生 长 点；c)用 锋 利 的 无 菌 解 剖 针 切 取 0.2 m m 以 下 的 带 1 个 2 个 叶 原 基 的 茎 尖，迅 速 接 种 于 茎 尖 培 养 基上，每 瓶 培 养 基 内 接 种 一 个 茎 尖；d)已 接 种 的 培 养 基 封 好

26、 口 后，在 容 器 上 注 明 编 号、品 种 名 称、接 种 时 间。6.6.3 在 剥 离 过 程 中，应 注 意 茎 尖 暴 露 的 时 间 越 短 越 好，切 下 的 茎 尖 不 应 与 已 剥 去 部 分、解 剖 镜 台 或持 芽 的 镊 子 接 触。每 剥 一 个 茎 尖 后，换 一 张 无 菌 滤 纸。6.7 茎 尖 培 养6.7.1 培 养 条 件：接 种 好 的 茎 尖 放 在 培 养 室 内 培 养，温 度 2 0 2 5，光 照 2 0 0 0 L u x 3 0 0 0 L u x，每 天 光 照 1 2 h。6.7.2 茎 尖 成 苗：茎 尖 培 养 两 周 后，成

27、 活 的 茎 尖 明 显 变 大 变 绿，5 0 d 6 0 d 左 右 茎 尖 长 成 带 1 片 2片 小 叶 的 无 根 小 芽，转 入 M S 培 养 基（配 方 参 见 附 录 B）中 继 续 培 养，3 0 d 左 右 长 成 带 4 片 5 片 叶 子的 完 整 试 管 苗。7 病 毒 检 测 和 品 种 真 实 性 鉴 定7.1 病 毒 检 测D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 167.1.1 在 超 净 工 作 台 上 取 出 试 管 苗 将 每 株 按 1 节 2 节 切 段，转 入 M S 培 养 基（配 方 参 见 附 录 B）进 行培 养，每 瓶 接 入

28、一 节 段，新 培 养 容 器 仍 然 使 用 与 试 管 苗 容 器 相 同 的 编 号 和 内 容。7.1.2 成 苗 后，每 个 编 号 的 抽 取 一 株 用 于 病 毒 检 测，检 测 方 法 执 行 N Y/T 4 0 1 2 0 0 0 的 规 定，通 过 检 测筛 选 出 不 含 P V X、P V Y、P V S、P L R V、P V M、P V A 等 病 毒 和 P S T V d 的 脱 毒 苗 核 心 苗。7.2 品 种 真 实 性 鉴 定7.2.1 试 种 观 察：对 应 编 号，将 经 检 测 不 带 病 毒 的 试 管 苗 取 出 一 部 分 移 栽 到 防

29、虫 网 棚，结 出 的 小 薯 种植 到 田 间 试 种 观 察，检 验 其 是 否 发 生 变 异。7.2.2 D N A 分 子 标 记：鉴 定 已 脱 毒 的 试 管 苗 与 原 品 种 的 关 系，检 测 方 法 执 行 N Y/T 1 9 6 3-2 0 1 0 的 规 定。若 试 管 苗 的 D N A 图 谱 与 原 品 种 的 一 致，则 判 定 二 者 为 同 一 品 种。8 核 心 苗 保 存 与 基 础 苗 培 养8.1 操 作 步 骤核 心 苗 保 存 培 养 基 配 方 见 附 录 F，基 础 苗 扩 繁 培 养 基 用 M S 培 养 基（配 方 见 附 录 B）或

30、 其 它 脱 毒 苗 扩繁 培 养 基（配 方 见 附 录 E），步 骤 如 下：a)在 超 净 工 作 台 上，用 7 5%酒 精 擦 拭 消 毒 核 心 苗 瓶 和 待 用 的 新 培 养 基 的 瓶 表 面，并 置 于 超 净 工 作台 上；b)用 经 灼 烧 消 毒 并 冷 却 好 的 镊 子 取 出 核 心 苗 置 于 无 菌 牛 皮 纸 上；c)按 茎 节 切 段，每 个 切 段 带 1 个 2 个 叶 片；d)从 剪 下 的 切 段 中 取 1 段 2 段，腋 芽 朝 上 插 入 核 心 苗 保 存 培 养 基 中 上，封 好 口，注 明 编 号、品种 名 称 及 接 种 时 间

31、；将 其 余 节 段 接 入 基 础 苗 扩 繁 培 养 基，封 好 口，注 明 编 号、品 种 名 称 及 接 种时 间。8.2 培 养 条 件8.2.1 核 心 苗 保 存 条 件：核 心 苗 保 存 要 放 入 相 对 低 温 的 种 质 资 源 保 存 室，使 其 缓 慢 生 长 保 存。温 度1 0 1 2、相 对 湿 度 7 0%、光 照 强 度 2 0 0 0 L u x 3 0 0 0 L u x、光 照 时 数 1 0 h/d。8.2.2 基 础 苗 培 养 条 件：温 度 2 2 2 5、相 对 湿 度 7 0%、光 照 强 度 2 0 0 0 L u x 3 0 0 0

32、L u x、光照 时 数 1 2 h/d。9 组 培 苗 扩 繁9.1 基 础 苗 复 检扩 繁 前 检 测 基 础 苗 是 否 带 病 毒（P V X、P V Y、P V S、P L R V、P V M、P V A）和 马 铃 薯 纺 锤 块 茎 类 病 毒（P S T V d）。按 照 N Y/T 4 0 1 2 0 0 0 的 附 录 A 和 附 录 B 给 出 的 方 法 进 行 检 测。9.2 培 养 基 制 备9.2.1 培 养 基 配 制：选 择 用 M S 固 体 培 养 基（配 方 参 见 附 录 B）或 其 他 扩 繁 培 养 基（配 方 参 见 附 录 E）。9.2.2

33、培 养 基 分 装：将 配 制 好 的 培 养 基 装 入 培 养 容 器 中（常 用 3 5 0 m l 的 罐 头 瓶），每 瓶 加 入 3 5 m l 4 0 m l 的 培 养 基，用 封 口 膜 或 盖 子 封 口。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 179.2.3 培 养 基 灭 菌：将 培 养 基 置 于 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅，在 压 力 为 1.1 k g/c m2、温 度 为 1 2 1 条 件 下 灭 菌2 5 m i n 3 0 m i n，取 出 后 在 洁 净 贮 存 室 放 置 3 d 5 d 待 用。9.3 无 菌 接 种无 菌 接 种 操 作

34、要 求 见 第 4 章。9.4 扩 繁9.4.1 检 测 合 格 的 基 础 苗 在 超 净 工 作 台 上 切 段 扩 繁，组 培 苗 扩 繁 按 以 下 程 序 操 作：a)用 7 5%酒 精 擦 拭 基 础 瓶 苗 和 备 用 的 培 养 基，表 面 消 毒 后 放 置 于 超 净 工 作 台 上 备 用；b)打 开 基 础 母 瓶，用 无 菌 剪 刀 把 苗 从 基 部 剪 断，用 无 菌 枪 状 镊 子 取 出 脱 毒 苗，置 于 事 先 准 备 好 的无 菌 牛 皮 纸 上；c)按 茎 节 切 断，每 个 切 段 带 1 个 2 个 叶 片；d)用 无 菌 镊 子 将 剪 好 的

35、茎 段 插 到 培 养 基 上，腋 芽 朝 上，每 瓶 插 1 5 个 2 0 个 茎 段；e)封 口 后，用 记 号 笔 注 明 编 号、品 种 名 称、接 种 时 间。9.4.2 每 个 操 作 人 员 配 备 两 套 接 种 工 具，交 替 灭 菌 使 用。每 接 种 完 一 瓶 基 础 母 瓶 后，将 镊 子、剪 刀 等工 具 插 入 7 5%酒 精 浸 蘸，并 在 酒 精 灯 上 灼 烧 数 秒 至 酒 精 干 透 或 插 入 接 种 工 具 消 毒 器 消 毒。转 接 下 一 个 母瓶 苗 时，应 使 用 另 一 套 消 毒 好 的 接 种 工 具，同 时 换 一 张 无 菌 牛

36、皮 纸。9.5 瓶 苗 培 养9.5.1 接 种 好 的 瓶 苗 放 入 培 养 室，白 天 2 2 2 5，夜 间 1 6 2 0，光 照 采 用 全 自 然 光 或 人工 光 源 日 光 灯：a)全 自 然 光 培 养：玻 璃 或 阳 光 板 建 成 的 全 自 然 光 培 养 室，光 照 强 度 控 制 在 4 0 0 0 L u x 1 0 0 0 0 L u x，当 光 照 强 度 超 过 1 0 0 0 0 L u x，光 照 强 度 过 强，不 利 于 组 培 苗 的 生 长，要 进 行 适 当 的 遮 阳；b)人 工 光 源 培 养：光 照 强 度 2 0 0 0 L u x

37、3 0 0 0 L u x，光 照 时 数 1 6 h/d。9.5.2 待 苗 长 出 6 片 7 片 叶 片，株 高 7 c m 8 c m 时，可 再 次 切 段 繁 殖 或 出 瓶 移 栽。脱 毒 苗 一 般 间 隔2 5 d 左 右 继 代 繁 殖 一 次。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 18附 录 A（规 范 性）组 培 设 施、设 备 及 药 品A.1 组 培 设 施 和 设 备A.1.1 防 酸 碱 台 面 的 试 验 台。A.1.2 冰 箱。A.1.3 药 瓶 柜。A.1.4 器 械 柜。A.1.5 高 压 灭 菌 锅。A.1.6 干 燥 箱。A.1.7 空 调

38、 和 降 温 设 施（湿 帘、风 机 等）。A.1.8 超 净 工 作 台。A.1.9 培 养 架（人 工 光 源 培 养 室 里 的 培 养 架 须 装 有 日 光 灯）。A.1.1 0 浸 泡 洗 涤 水 槽 和 冲 洗 水 槽。A.1.1 1 培 养 瓶 控 水 架。A.1.1 2 装 培 养 瓶（或 培 养 基）的 塑 料 周 转 筐 若 干 个。A.1.1 3 0.1 g 电 子 天 平、0.0 0 0 1 g 电 子 天 平。A.1.1 4 电 动 搅 拌 机。A.1.1 5 磁 力 搅 拌 机。A.1.1 6 酸 度 计。A.1.1 7 蒸 馏 水 器。A.1.1 8 不 锈 钢

39、 锅 或 陶 瓷 桶。A.1.1 9 电 磁 炉。A.1.2 0 各 种 规 格 的 容 量 瓶、棕 色 细 口 瓶、棕 色 广 口 瓶、移 液 管、烧 杯、量 筒、玻 璃 棒、吸 管、洗 耳 球、试 剂 勺 等。A.1.2 1 大 量 的 试 管、三 角 瓶、培 养 瓶A.1.2 2 瓶 盖、封 口 膜、线 绳。A.1.2 3 紫 外 灯。A.1.2 4 酒 精 灯。A.1.2 5 镊 子、剪 刀、手 术 刀、解 剖 针、解 剖 刀。A.1.2 6 温、湿 度 仪。A.2 药 品A.2.1 氯 化 汞。A.2.2 高 锰 酸 钾。A.2.3 次 氯 酸 钠。A.2.4 7 5%乙 醇、9 5

40、%乙 醇。A.2.5 6-苄 氨 基 腺 嘌 呤（6-B A）、萘 乙 酸（N A A）、吲 哚 乙 酸（I A A）、赤 霉 素（G A 3）、激 动 素（K T）、D-泛 酸 钙。A.2.6 硫 脲。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 19A.2.7 新 洁 尔 灭。A.2.8 优 氯 净。A.2.9 p H 试 纸。A.2.1 0 琼 脂、卡 拉 胶。A.2.1 1 食 用 白 糖、蔗 糖。A.2.1 2 附 录 B 附 录 E 中 的 所 有 试 剂。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 11 0附 录 B（规 范）M S 培 养 基 配 方 和 母 液 配 制

41、要 求B.1 M S 培 养 基 配 方M S 培 养 基 配 方 见 表 B.1。表 B.1 M S 培 养 配 方 表成分 化学试剂 质量浓度（m g/L）大量元素硝酸钾（K N O3）硝酸铵(N H4N O3)磷酸二氢钾(K H2P O4)硫酸镁(M g S O47 H2O)氯化钙(C a C l22 H2O)1 9 0 01 6 5 01 7 03 7 04 4 0微量元素硫酸锰（M n S O44 H2O）硫酸锌（Z n S O47 H2O）硼酸（H3B O3）碘化钾（K I）钼酸钠（N a2M o O42 H2O）硫酸铜（C u S O45 H2O）氯化钴（C o C l26 H2

42、O）2 2.38.66.20.8 30.2 50.0 2 50.0 2 5铁盐乙二胺四乙酸二(N a2E D T A 2 H2O)硫酸亚铁（F e S O47 H2O）3 7.32 7.8有机物质肌醇甘氨酸盐酸硫胺素（B1）盐酸吡哆醇（B6）烟酸1 0 020.10.50.5食用白糖（蔗糖）3 0 g/L琼脂粉 6.5 g/LB.2 M S 培 养 基 母 液 配 制 要 求B.2.1 大 量 元 素 母 液 的 配 制：大 量 元 素 用 量 相 对 较 大，其 中 K N O3、N H 4 N O3在 配 制 培 养 基 时 按 实 际 配 制 的体 积 来 称 取，随 称 随 用，其 余

43、 3 种 以 每 种 试 剂 单 独 配 制 成 母 液。B.2.2 微 量 元 素 母 液 的 配 制：7 种 微 量 元 素 逐 一 称 取、溶 解 后 定 容 成 一 种 母 液。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 11 1B.2.3 铁 盐 母 液 的 配 制：两 种 试 剂 分 别 称 量 并 分 别 加 热 溶 解，待 两 种 试 剂 均 溶 解 后 混 合，混 合 后 的 溶液 继 续 加 热 使 其 充 分 螯 合，冷 却 后 定 容 备 用。B.2.4 有 机 物 质 母 液 的 配 制：肌 醇 在 配 制 培 养 基 时 按 实 际 配 制 的 体 积 来 称

44、取，随 称 随 用，其 余 4 种 有 机物 质 逐 一 称 取、溶 解 后 定 容 成 一 种 母 液。B.2.5 M S 固 体 培 养 基：M S 培 养 基+食 用 白 糖（蔗 糖）3 0 g/L+琼 脂 粉 6.5 g/L，p H 5.8。D B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 11 2附 录 C（规 范 性）无 菌 苗 培 养 基 配 方无 菌 苗 培 养 基 配 方 见 表 C.1。表 C.1 无 菌 苗 培 养 基 配 方 表成 分 化 学 试 剂 质 量 浓 度大量元素硝酸钾（K N O3）硝酸铵(N H4N O3)磷酸二氢钾(K H2P O4)硫酸镁(M g S O

45、47 H2O)氯化钙(C a C l22 H2O)1 9 0 0 m g/L1 6 5 0 m g/L1 7 0 m g/L3 7 0 m g/L4 4 0 m g/L微量元素硫酸锰（M n S O44 H2O）硫酸锌（Z n S O47 H2O）硼酸（H3B O3）碘化钾（K I）钼酸钠（N a2M o O42 H2O）硫酸铜（C u S O45 H2O）氯化钴（C o C l26 H2O）2 2.3 m g/L8.6 m g/L6.2 m g/L0.8 3 m g/L0.2 5 m g/L0.0 2 5 m g/L0.0 2 5 m g/L铁盐乙二胺四乙酸二(N a2E D T A 2 H

46、2O)硫酸亚铁（F e S O47 H2O）3 7.3 m g/L2 7.8 m g/L有机物质肌醇甘氨酸盐酸硫胺素（B1）盐酸吡哆醇（B6）烟酸1 0 0 m g/L2 m g/L0.1 m g/L0.5 m g/L0.5 m g/L激素6-苄基氨基腺嘌呤(6-B A)萘乙酸（N A A）赤霉素(G A3)0.3 m g/L 1 m g/L0.0 5 m g/L 0.1 m g/L0.2 m g/L糖 食用白糖（蔗糖）3 0 g/L其它 琼脂粉 6.5 g/LD B 5 3 0 1/T 6 7 2 0 2 11 3附 录 D（规 范 性）茎 尖 培 养 基 配 方茎 尖 培 养 基 配 方

47、见 表 D.1。表 D.1 茎 尖 培 养 基 配 方 表成分 化学试剂质量浓度M SaF A O(1 9 8 6)bC I Pc大量元素硝酸钾（K N O3）1 9 0 0 m g/L 1 9 0 0 m g/L 1 9 0 0 m g/L硝酸铵(N H4N O3)1 6 5 0 m g/L 1 6 5 0 m g/L 1 6 5 0 m g/L磷酸二氢钾(K H2P O4)1 7 0 m g/L 1 7 0 m g/L 1 7 0 m g/L硫酸镁(M g S O47 H2O)3 7 0 m g/L 3 7 0 m g/L 3 7 0 m g/L氯化钙(C a C l22 H2O)4 4

48、0 m g/L 4 4 0 m g/L 4 4 0 m g/L微量元素硫酸锰（M n S O44 H2O 2 2.3 m g/L 0.5 m g/L 2 2.3 m g/L硫酸锌（Z n S O47 H2O）8.6 m g/L 1.0 m g/L 8.6 m g/L硼酸（H3B O3）6.2 m g/L 1.0 m g/L 6.2 m g/L碘化钾（K I）0.8 3 m g/L 0.0 1 m g/L 0.8 3 m g/L钼酸钠（N a2M o O42 H2O）0.2 5 m g/L 0.2 5 m g/L硫酸铜（C u S O45 H2O）0.0 2 5 m g/L 0.0 3 0.0

49、2 5 m g/L氯化钴（C o C l26 H2O）0.0 2 5 m g/L 0.0 2 5 m g/L铁盐乙二胺四乙酸二(N a2E D T A 2 H2O)3 7.3 m g/L 3 7.3 m g/L 3 7.3 m g/L硫酸亚铁（F e S O47 H2O）2 7.8 m g/L 2 7.8 m g/L 2 7.8 m g/L有机物质肌醇 1 0 0 m g/L 1 0 0 m g/L 1 0 0 m g/L甘氨酸 2.0 m g/L 2.0 m g/L盐酸硫胺素（B 1）0.5 m g/L 1.0 m g/L 0.5 m g/L盐酸吡哆醇（B 6）0.5 m g/L 1.0 m

50、 g/L 0.5 m g/L烟酸 0.5 m g/L 1.0 m g/L 0.5 m g/L硫酸盐腺嘌呤 8 0 m g/L 0.2 5 m g/L泛酸钙 0.5 m g/L 2.0 m g/L激素生物素 0.2 m g/L 激动素（K T）0.0 4 m g/L 1.0 m g/L 吲哚乙酸（I A A）0.1 m g/L 2.0 m g/L 糖 食用白糖（蔗糖）3 0 g 2 0 g 3 0 g其它 琼脂粉 6.5 g 8 g 6 ga茎尖培养基为 M S 培养基加激素。b联合国粮农组织推荐的茎尖培养基配方，见G B/T 2 9 3 7 5 2 0 1 2，附录B 表B.1。c国际马铃薯中