DB32 T 3762.13-2021 新型冠状病毒检测技术规范 第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序.pdf

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1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB32/T 3762.13 2021 新型冠状 病毒检测 技术规范 第 13 部分 ：叠氮溴 化丙锭- 荧光 PCR 检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 13: PMA-qRT-PCR test procedure 2021 - 12 - 09 发布 2022 - 01 - 09 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.13 2021 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规 范性 引用 文件

2、. 1 3 术 语和 定义 . 1 4 环 境与 设施 . 1 5 设 备与 耗材 . 1 6 试 剂与 材料 . 1 7 试 验技 术要 点 . 2 8 样 本前 处理 . 2 9 样本 PMA 预处 理与 核 酸提取 . 2 10 扩 增体 系配 制与 扩增 . 2 11 阈 值设 定 . 3 12 样 本前 处理 . 3 13 结 果判 断 . 3 DB32/T 3762.13 2021 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分 ： 第1部 分： 生物 样本 采 集、运 输和 保存 ； 第2部 分： 病毒 分离 与 鉴定； 第3部

3、分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 ； 第4部 分： 重组 酶介 导 等温扩 增程 序； 第5部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序； 第6部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序 ； 第7部 分： 空气 样本 检 测与评 估； 第8部 分： 物体 表面 检 测与评 估； 第9部 分： 医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估； 第10部 分： 微量 血清 中和试 验； 第11部 分： 全基 因组 高通量 测序 ； 第12部 分： 药物 体外 抗病毒 效果 测定 ； 第13部 分： 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR 检测 程序 ； 第14部

4、分：N 亚基 因 组荧光PCR 检测 程序 ； 第15部 分： 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发光法 检测 程序 ； 第16部 分： 核酸 数字PCR 法； 第17部 分： 核酸 检测 用假病 毒阳 性质 控品 ； 第18部 分： 规模 化核 酸检测 程序 。 本 文件 为DB32/T 3762 的第13部 分。 本 文件 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导 则 第1 部 分： 标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起 草。 本 文件 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出 。 本 文件 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。 本 文件 主

5、要 起草 单位 ： 江 苏省疾 病预 防控 制中 心 、 扬州市 疾病 预防 控制 中心 、 南 京市 疾病 预防 控制 中心、 宿迁 市疾 病预 防控 制中心 。 本 文件 主要 起草 人： 葛以 跃 、 崔 仑标 、 刘 丹丹 、 朱 宝立、 迟莹 、 吴 涛、 朱小 娟、 吴 斌、 赵康 辰 、 乔 乔、徐 勤、 杜雪 飞、 戚晓 飞 。 DB32/T 3762.13 2021 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第 13 部 分： 叠氮 溴化丙 锭- 荧光 PCR 检测程序 1 范围 本 文件 规定 了新 型冠 状病 毒 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR （PMA-qRT-PCR ） 检

6、 测环 境与设 施 、 设 备与 耗 材、试 剂与 材料 、样 本处 理 与核 酸提 取、 扩增 体系 配制与 扩增 和结 果判 断 。 本 文件 适用 于 新 型冠 状病 毒 PMA-qRT-PCR 检测， 为 判断 样 本中 的新 型冠 状病 毒 是否 具有 感染 性 提 供辅助 手段 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改版 ） 适 用 于 本 文件。

7、DB32/T 3762.3 新 型冠 状 病毒检 测技 术规 范 第3 部分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 新型冠 状病 毒实 验室 生物 安全指 南 中 华人 民共 和 国国家 卫生 健康 委员 会 新型冠 状病 毒肺 炎实 验室 检测技 术指 南 中 华人 民 共和国 国家 卫生 健康 委员 会 医疗机 构临 床基 因扩 增管 理办法 原中 华人 民共 和 国 卫生 部办 公厅 医疗机 构临 床基 因扩 增检 验实 验 室工 作导 则 原 中华人 民共 和国 卫生 部检 验中心 3 术语和 定义 3.1 叠氮溴 化丙 锭 propidium monoazide ；PMA 一种 具有 高亲

8、和 力的光 敏反 应DNA 结 合染料 ，光解后 ，染料 上的光 敏叠氮 基转 变为高 反应性 的氮 烯自由 基 ， 极 容易 与结 合部 位核酸 的碳 氢化 合物 形成 牢固RNA 或DNA 修饰 ， 修 饰后的 核酸 不能 用 作PCR 反应 模板 被扩增 。由于PMA 不能透 过活细胞 膜 ，因此 将PMA 与PCR 联合 使用 可用 于区分死活 细胞、细 菌和 病 毒等 。 4 环境与 设施 同DB32/T3762.3 第4 章 。 5 设备与 耗材 BLU-V 曝光系 统 或 卤素 灯 （650 W ） ，余 同DB32/T3762.3 第5章 。 6 试剂与 材料 6.1 试剂 D

9、B32/T 3762.13 2021 2 6.1.1 病毒核 酸提 取试 剂盒 。 6.1.2 qRT-PCR扩增 试 剂盒 。 6.1.3 二甲基 亚砜 （DMSO ）。 6.1.4 磷酸盐 缓冲 液（PBS ，PH=7.4 ） 。 6.1.5 叠氮溴 化丙 锭（PMA ） 。 6.2 材料 6.2.1 新型冠 状病 毒核 酸检 测 质 控品 。 6.2.2 消毒剂 ：75 % 乙 醇、 有效 氯5 500 mg/L 的消毒液 （需 每天新 鲜配 制） 。 7 试验技 术要 点 用于新 型冠 状病 毒核酸PMA-qRT-PCR检测 的 样本 应 采用非 灭活 型病 毒采 样管 进行采 集 。

10、 8 样本前 处理 8.1 在 BSL-2 实验 室生 物安 全 柜内打 开样本 第 二层 包 装 ， 取出 待检 样本， 核对 送 检单， 若管 壁外 有不 明液体 ，应 用 消 毒剂 擦拭 。 8.2 将样本 混匀 后分 装 于 2 mL 带螺旋盖内 有垫 圈冻 存 管。在 冻存 管上 标记 ，注 明姓名 、样 本类 型 、 日期等 。吸 取部 分样 本进 行样 本 PMA 预处 理与 核酸 提取。 所有 冻存 管旋 紧管 盖后需 用封 口膜 密封 。 9 样本 PMA 预 处理 与核 酸提 取 9.1 样本 PMA 预 处理 9.1.1 以 20 % 二甲 基亚 砜（DMSO ）将 PM

11、A 配置 成 2 mM 浓度。 9.1.2 将 PMA 加入 到病 毒样 品 中使其 达 到 200 M 终 浓度 ，同时 取等 量 PBS 加入 到 病毒样 本中 作为 样品对 照组 ， 并 做好 标记 。 以同 样的 方法 对 新 型冠 状病毒 核酸 检测 质控 品 （ 稀释 到 500 拷贝/mL ） 进行 处理。 9.1.3 将所有 样品 管混 合均 匀， 室温孵 育 10 min 。 9.1.4 孵育完 成后 使 用 BLU-V 曝 光系统 或卤 素灯 （650 W ， 样品置 于冰 上， 距离 灯源 20 cm ） 曝光 15 min 。 注： 以上步骤均在避光条件下进行 。 9.

12、2 核酸提 取 同 DB32/T3762.3 的7.2 条 。 10 扩增体 系配 制 与 扩增 10.1 将 qRT-PCR 扩 增引 物和探针 （Forward ：5-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA- 3 ；Reverse ： 5-ACGATTGTGCATCAGCTGA- 3 ；Probe ：5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -BHQ1- 3 ）配置为 10 M 浓度。 DB32/T 3762.13 2021 3 10.2 采用 qRT-PCR 扩增 试剂 盒 ， 根 据试 剂盒 说明 书配 置 qRT-PCR 扩 增体 系， 反应 体 系中

13、每 一条 引物 的终浓 度 为 0.2 M ，每 个 样品 及 新型 冠状 病毒 核酸 检测 质 控品 均 做 3 个 重复 ，同时 设立 阴性 对照 。 10.3 在生物 安全 柜 内 加核 酸模 板，然 后 根 据试 剂盒 说明 书 设定 反应 条件 进行 qRT-PCR 扩增 ， 共扩 增 40 个 循环 。 10.4 在实验 记录 本记 录加 样位 置和样 本编 号。 10.5 未用完 核酸 样本 转入 病毒 样本专 用专 人保 管冰 箱。 11 阈值设 定 阈值设 定原 则以 阈值 线刚 好超过 阴性 对照 扩增 曲线 的最高 点， 结果 显示 阴性 为准。 12 质 控标 准 阴性

14、对 照结 果为 阴性 。 新 型冠状 病毒 核酸 检测 质控 品 PBS 处理 组 出 现典型 S 型扩 增曲 线 ，Ct 值小 于40 ， 且 质控 品PBS处理组Ct 值和PMA 预处 理 组Ct 值 之间 存在 统计 学差异 （ 阴性结 果Ct 值记 为40 ） ；若 以上对 照不 成立 ，此 次实 验视为 无效 。 13 结果判断 记录各 组样品Ct 值， 阴性 结果Ct 值记 为40 。 如果 样品PMA 预 处理 组Ct 值和PBS 处理 对照 组Ct 值之间 无统计 学差 异 ， 则 提示 样 品中的 病毒 具有 感染 性 的 可能性 较大 ； 如果PMA 预 处理组Ct 值和PBS 处理 对 照 组Ct 值 之间 存在 统计 学差 异， 则 提示 样品 中的 病毒 无感染 性或 者感 染性 较低 。 具体 判定 需结 合样品实际 情况进 行综 合分 析。 _