SF T 0114-2021 生物检材中吗啡、O6-单乙酰吗啡和可待因的检验方法.pdf

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1、 ICS 07.140 CCS C06 SF 中 华 人 民 共 和 国 司 法 行 政 行 业 标 准 SF/T 0114 2021 代替 SF/Z JD0107006 2010 生物检材 中吗啡、O 6 - 单乙酰吗啡和可 待因 的检验方 法 Determination of morphine,O 6 -monoacetylmorphine and codeine in biological sample 2021 - 11 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 中华人民 共和国 司 法部 发 布 SF/T 0114 2021 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2

2、 规 范性 引用 文件 . 1 3 术 语和 定义 . 1 4 原理 . 1 5 试 剂、 仪器 和材 料 . 1 6 定 性分 析 . 2 7 定 量分 析 . 5 8 分 析结 果评 价 . 6 附录A （资 料性 ） 血液 、尿液 和组 织中 吗啡 、O 6 - 单乙酰 吗啡 和可 待因 的检 出限 . 8 SF/T 0114 2021 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定 起草。 本 文 件 代 替SF/Z JD01070062010 生 物 检 材 中 单 乙 酰 吗 啡 、 吗 啡

3、 、 可 待 因 的 测 定 ， 与SF/Z JD01070062010 相 比， 除 结构调 整和 编辑 性改 动外 ，主要 技术 变化 如下 ： a) 删除了 免疫 筛选 法和 毛发 检验表 述（ 见2010 年版 的 第 1 章 ）； b) 删除了 免疫 筛选 法（ 见 2010 年 版的 第3 章、 第 4 章 、第5 章和 第6 章） ； c) 增加了 控制 样品 （ 见 6.1.1.3 和6.1.2.3 ）； d) 删除了 毛发 提取 （ 见 2010 年版 的10.1.5 和16.1.4 ）； e) 增加了 分析 结果 评价 （见 第 8 章 ）。 请注意 本文 件的 某些 内容

4、 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本文件 由 司 法鉴 定科 学研 究 院提 出。 本文件 由 司 法部 信息 中心 归口。 本文件 起草 单位 ： 司 法鉴 定科学 研究 院。 本文件 主要 起草 人： 刘伟 、卓先 义、 向平 、沈 保华 、严慧 、施 妍、 陈航 。 本文件 及其 所代 替文 件的 历次版 本发 布情 况为 ： 2010 年首 次发 布为SF/Z JD0107006 2010 ； 本次 为 第一 次修订 。 SF/T 0114 2021 1 生 物检材 中吗啡、O 6 - 单 乙酰吗 啡和 可待因 的检验方 法 1 范围 本文件

5、 描述 了生 物检 材 （ 血液、 尿液 及组 织） 中吗 啡、O 6 - 单乙 酰吗 啡 和 可待 因 的气 相色 谱- 质谱 和 液相色 谱- 串联 质谱 检验 方 法， 包 括原 理、 试 剂、 仪器 和材料 、 定性 分 析、 定 量分 析 以及 分析 结 果 评价 。 本文件 适 用于血液、尿液及组织中 吗啡、O 6 -单乙酰吗啡和可 待因 的定性定量分析 ，其 它检材中吗 啡、O 6 - 单 乙酰 吗啡 和可 待 因的定 性定 量分 析参 照使 用。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注

6、日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GA/T 122 毒物 分析 名词 术语 3 术语和 定义 GA/T 122 界 定的 术语 和定 义适用 于本 文件 。 4 原理 生物检 材中 吗啡 、O 6 - 单乙 酰吗啡 和可 待因 在pH 值约为9.2 时用 氯仿: 异丙 醇 （9:1 ） 提取（ 气相 色 谱 -质谱法 分析 前需衍 生化 ） ，用气 相色谱-质谱 法和 液 相色谱- 串联 质谱法

7、 进行 检 测， 经 与平行 操作 的 空 白样品 和添 加样 品 比 较， 以保留 时间 、 特 征离 子 （ 对） 和 离子 （ 对） 丰度 比 进行 定 性分 析； 以定 量离 子 （对） 峰面 积为 依据 ，采用 外标 法进行 定量 分析 。 5 试剂 、 仪器 和材 料 试剂 气相色 谱- 质谱 试验 用水 应 符合 GB/T 6682 中 规定 的三 级水 ， 液 相色 谱- 串联 质 谱试验 用水 应符 合 GB/T 6682 中规定 的一 级水 。除 另有 说明 外， 在分 析中使 用的 试剂 均为 分析 纯，试 剂包 括 ： a) 10%氢 氧化 钠溶 液； b) 硼砂缓 冲

8、液 ：pH 值为 9.2 ； c) 氯仿； d) 异丙醇 ； e) 丙酸酐 ； f) 吡啶； g) 乙酸铵 ：HPLC 级 ； h) 50%甲 酸溶 液：HPLC 级； i) 乙腈：HPLC 级 ； j) 甲醇：HPLC 级 ； k) 正丁醇 ； l) 浓盐酸 ； m) 0.1mol/L 盐酸 溶液 ； SF/T 0114 2021 2 n) 20mmol/L 乙酸 铵 溶 液（含 0.1% 甲 酸） ：分 别称 取乙 酸铵 1.54g 和移 取 50% 甲 酸溶 液 2mL 置于 1000mL 容 量瓶 中， 加水 定 容至刻 度，pH 值约 为 4； o) 混合溶 液 乙腈:20mmol/

9、L 乙酸铵 溶液 （含 0.1%甲酸） （7:3 ，v/v ）； p) 标准物 质溶 液 ： 1) 吗啡、O 6 -单 乙酰 吗啡 和可 待因 标 准物 质 储 备液 ： 分 别取吗 啡、O 6 -单 乙酰 吗啡 和 可待 因 标 准物质 ， 精 密称 取适 量， 用甲醇 配 成1.0mg/mL 的 标 准储备 液。 密封， 置于 冰 箱中冷 冻保 存，有 效期 为 12 个月 ； 2) 吗啡、O 6 -单乙酰吗啡和可待因 标准物质工作液：试验中所用其它浓度的标准物质工作液 均由符合 5.1 p) 1 ）的 标 准物质 储备 液用 甲醇 稀释 而得。 密封 ，置 于冰 箱中 冷藏保 存 。 有

10、效期 为3 个月 。 仪器 和 材料 仪器和 材料 包括 ： a) 气相色 谱- 质谱 仪（GC-MS ）：配 有电 子轰 击源(EI) ； b) 液相色 谱- 串联 质谱 仪（LC-MS/MS ）： 配有 电喷 雾离 子源(ESI) ； c) 电子天 平： 分度 值 0.1mg ； d) 涡旋振 荡器 ； e) 离心机 ：转 速4000r/min ； f) 高速 离 心机 ：转 速14000r/min ； g) 恒温水 浴锅 ； h) 移液器 ； i) 具塞离 心管 ； j) 微波炉 ； k) 微孔滤 膜：0.22 m 。 6 定性分 析 样品 前 处理 6.1.1 衍生化 法 6.1.1.

11、1 适用方 法 衍生化 法适 用于 采用 气相 色谱- 质谱 法进 行分 析的 样 品前处 理。 6.1.1.2 案件样 品 6.1.1.2.1 尿液样 品 取尿液 样品2mL 置于10mL 具 塞离心 管中， 用10% 氢氧 化 钠溶液 调pH值 至9.0 9.2 ，加入1mL硼 砂缓 冲 液， 用氯 仿:异 丙醇(9:1 ，v/v)3mL 提 取， 涡旋 混合 、 离心 ， 转 移有 机层 至另 一 离心管 中 ， 约60 C水 浴中 空气流 下吹 干 。 残 留物 中加 入丙酸 酐50 L 和吡啶20 L ， 混 匀后 密封 ， 置于 微 波炉 （500W ） 中衍 生化3min ， 6

12、0 C水 浴中 空气 流下 吹干 ，残留 物用30 L 甲 醇溶 解 ，取1 L 进气 相色 谱-质 谱 仪分析 。 6.1.1.2.2 尿液中 总吗 啡或 可待 因的 提取 取尿液 样品2mL 置于10mL 具 塞离心 管中 ， 加入0.2mL 浓 盐酸 ， 沸 水浴 中水 解30min ， 冷 却后 加入1mL 正 丁醇， 涡旋 混合 、离 心， 弃去有 机层 ，用10% 氢 氧 化钠溶 液调pH值 至9.0 9.2 ，然后 按照6.1.1.2.1 方 法操作 。 6.1.1.2.3 血液样 品 SF/T 0114 2021 3 取血液 样品2mL 置于10mL 具 塞离心 管中， 加入

13、硼砂缓 冲液2mL ，用 氯仿: 异丙醇(9:1 ，v/v)3mL 提取 ， 然后按照6.1.1.2.1 方法 操 作 。 6.1.1.2.4 组织样 品 将组织 样品剪 碎或 匀浆， 称取2g ，加入2mL水 ，再 加 入0.4mL 浓盐 酸， 沸水浴 中 水解30min ， 离心 ， 取上清 液，用10% 氢 氧化 钠 溶液调pH值 至9.0 9.2 ， 然后按照6.1.1.2.1 方法 操 作 。 6.1.1.3 控制样 品 取 等量相 同或相似基质的 空白检材 两份，一份作为空白样品 ，一份添加吗啡、O 6 -单乙酰 吗啡和 可 待因标 准物 质工 作液 （ 血 液、 尿液 添加 样品

14、 质量 浓 度为0.1 g/mL ， 组织 添加 样品质 量分 数为0.2 g/g ） ， 与案件 样品 平行 操作 。 6.1.2 直接提 取法 6.1.2.1 适用方 法 直接提 取法 适用 于采 用液 相色谱-串 联质 谱法 进行 分 析的样 品前 处理 。 6.1.2.2 案件样 品 6.1.2.2.1 尿液样 品 取尿液 样品2mL 置于10mL 具 塞离心 管中， 用10% 氢氧 化 钠溶液 调pH值 至9.0 9.2 ，加入1mL 硼 砂缓 冲 液， 用氯 仿: 异 丙醇(9:1 ，v/v)3mL 提 取， 涡旋 混合 、 离心 ， 转 移有 机层 至另 一 离心管 中 ， 约6

15、0 C水 浴中 空气流 下吹 干 。 残 留物 用 混合溶 液 乙腈:20mmol/L 乙酸铵 溶液 （含0.1% 甲 酸 ） （7:3 ， v/v ） 100 L复 溶， 过0.22 m 微孔 滤膜 ，供 液 相色谱-串 联质 谱仪 分析 。 6.1.2.2.2 血液样 品 取血液 样品2mL 置于10mL 具 塞离心 管中， 加入2mL 硼 砂 缓冲液 ，用氯 仿:异 丙醇(9:1 ，v/v)3mL 提取， 然后按照6.1.2.2.1 方法 操 作。 6.1.2.2.3 组织样 品 将组织 样品剪 碎或 匀浆， 称取2g ，加入2mL水 ，再 加 入0.4mL 浓盐 酸 ， 沸水浴 中 水

16、解30min ， 取出 ， 用10% 氢氧 化钠 溶液 调pH 值 至9.0 9.2 ，然后 按照6.1.2.2.1 方法 操作 。 6.1.2.3 控制样 品 取 等量相 同或相似基质的 空白样品 两份，一份作为 空白样品 ，一份添加吗啡、O 6 -单乙酰 吗啡和可 待因标 准物 质工 作液 （ 血液 、 尿 液添 加样 品质 量浓 度为0.01 g/mL ， 组织 添加 样品 质量分 数为0.02 g/g）， 与案件 样品 平行 操作 。 仪器分析 6.2.1 仪器条 件 6.2.1.1 气相色 谱- 质谱 参考 条件 气相色谱- 质谱 参考 条件 如 下 ，应 用时 可根 据不 同品 牌

17、仪器 的实 际情 况进 行调 整。 a) 色谱柱 ：HP-1MS 毛 细管 柱(30m0.25mm0.25m) 或其 它等效 柱 ； 注： HP-1MS 柱为Agilent 公 司产 品 的商 品 名 称， 给 出这 一 信息 是 为了 方 便 本文 件 的使 用 者， 并 不是 表 示 对该 产 品的 认可。如果其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：100C 保持 1.5min ，以 25 C/min 程 序升 温 至280C，保持 15min ； c) 载气： 氦气 ，纯 度99.999% ，流 速：1.0mL/min ； d) 进样口 温度 ：250 C； e)

18、 进样量 ：1 L ； SF/T 0114 2021 4 f) 电子轰 击源 ：70eV ； g) 四极杆 温度 ：150 C； h) 离子源 温度 ：230 C； i) 接口温 度：280C ； j) 扫描 方 式： 选择 离子 监测 （SIM ）； k) 吗啡、O 6 - 单乙 酰吗 啡及 可 待因衍生 物 的保 留时 间与 特征离 子见 表 1 。 表1 吗啡、O 6 - 单乙 酰吗 啡及 可 待因 衍 生物 的保 留时 间与 特征离子 化合物 保留时间 min 特征离子 m/z 吗啡丙酰化物 13.8 341 a ,397,268 O 6 - 单乙酰吗啡丙酰化物 12.6 327 a

19、,383,268 可待因丙酰化物 11.6 229 a ,355,282 a 为定量离子。 6.2.1.2 液相色 谱- 串联 质谱 参考 条 件 液相色谱- 串联 质谱 参考 条 件 如下 ，应 用时 可根 据不 同 品牌 仪器 的实际 情况 进 行调整 。 a) 色谱柱 ：Allure PFP Propyl 液 相色 谱柱 （2.1mm 100mm 5 m） 或其 它等 效柱 ， 前接保 护柱； 注： Allure PFP Propyl 柱为Restek 公司产品的商品名称， 给出这 一信息是为了方便本文件的使用者， 并不是表示 对该产品的认可。如果其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些

20、等效产品。 b) 流动相 ：A 为乙 腈，B 为20mmol/L 乙 酸铵 溶液 （含0.1% 甲 酸） ，A:B=70:30 ； c) 流速：200 L/min ； d) 柱温： 室温 ； e) 进样量 ：5 L 。 f) 离子源 ：电 喷雾 电离-正 离 子模式(ESI+) ； g) 离子源 电压(IS):5500V ； h) 扫描方式 ： 多反 应监 测(MRM) ； i) 碰撞气(CAD) 、 气帘 气(CUR) 、 雾 化气(GS1) 、 辅助 气(GS2) 均 为高 纯氮 气 ， 使 用 前调节 各气 流流 量以使 质谱 灵敏 度达 到检 测要求 ； j) 去簇电 压(DP) 、

21、碰撞 能量(CE) 应 优化 至最 佳灵 敏度 ； k) 吗啡、O 6 -单乙酰吗啡及 可待因的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量和保留时 间 见表2 。 表2 吗啡、O 6 - 单乙 酰吗 啡和 可 待因的 定性 离子 对、 定量 离子对 、去 簇电 压、 碰撞 能量和 保留 时间 6.2.2 进样 分别吸 取案 件样 品、 空白 样品和 添加 样品 提取 液， 按6.2.1规定 的 条件 进样 分 析。 记录 记录 案 件样 品、 空白 样品 和添加 样品 中可 疑色 谱峰 的保留 时间 、 特 征离 子 （ 对） 和 离子 （ 对） 丰 度 比。 方 法检 出限 参见 附录A 。

22、 化合物 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 保留 时间 min 吗啡 286.1/201.2 a 80 36 2.76 286.1/165.3 56 O 6 - 单乙酰吗啡 328.1/211.3 a 80 36 4.16 328.1/165.3 54 可待因 300.2/199.2 a 80 40 3.65 300.2/165.3 60 a 为定量离子对。 SF/T 0114 2021 5 定性判 断依 据 6.4.1 气相色 谱- 质谱 法 以保留 时间 、 特 征离 子和 离子丰 度比 作为 定性 判断 依据。 如果 案 件样 品 中出 现 目标物 的 定 性离 子 的特 征 色

23、谱峰 ， 保 留时 间 与添 加 样品中 相 应 标准 物 质的 色 谱峰保 留时 间比 较 ，相 对 误差在2%内，在样 品质 谱 图中 ，所 选择 的离 子均 出 现， 且定 性离 子丰 度比 与 添加样 品的 离子 丰度 比之 相对误 差不 超过 表3 规定 的 范围， 则可 判定 案件 样品 中存在 该种 目标 物。 表3 离子丰 度比 的最 大允 许 相 对误 差 单位为百分数（% ） 离子丰度比 50 2050 1020 10 允许的相对误差 10 15 20 50 6.4.2 液相色 谱- 串联 质谱 法 以保留 时间 、特 征离 子 对 和离子 对丰 度 比 作为 定性 判断依

24、 据 。 如 果 案 件样 品 中出 现 目标物 的 两 对定 性 离子 对 的特征 色 谱 峰， 保 留时 间 与添加 样 品 中相 应 标准 物 质的色 谱峰 保留 时间 比较 ，相 对误 差在2.5% 内， 且 定性离 子对 丰度 比与 添加 样品的 离子 对丰 度比 之 相 对误差 不超 过表4规 定的 范 围，则 可判 定案 件样 品中 存在目 标物 成分 。 表4 离 子 对 丰 度 比 的 最 大 允 许 相 对 误 差 单位为百分数（% ） 离子对丰度比 50 20 50 10 20 10 允许的相对误差 20 25 30 50 7 定量分 析 分析方 法 采用外 标- 工作

25、曲线 法或 外 标-单 点法 定量 分析 。 样品前 处理 取案件 样品 两份 ，然 后按 照6.1 的方法 操 作。 另取相 同或 相似 基质 空白 样品若 干份 ， 添加 适量 目 标物 ， 制 得系 列浓 度或 单 点浓度 的添 加样 品 ， 与 案件样 品平 行操 作。 案件样 品中 目标 物的 浓度 应在工 作曲 线的 线性 范围 内。 配 制单 点浓 度的 添加 样品时 ， 案 件中 目标 物 浓度应 在单 点浓 度的 50% 内。 仪器分析 7.3.1 仪器条 件 仪器条件 应 符合6.2.1 的 规定 。 7.3.2 进样 分别将 案件 样品 、系 列浓 度的添 加样 品或 单

26、点 浓度 添加样 品， 按照6.2.1规定 的 条件 进样 分析 。 记录与 计算 7.4.1 记录 记录案 件样 品、 系列 浓度 的添加 样品 或单 点浓 度添 加样中 目标 物定 量离 子 （ 对） 的 峰面 积值 ， 然 后 计算案 件样 品中 目标 物的 含量 。 7.4.2 外标- 工作 曲线 法 SF/T 0114 2021 6 在系列 浓度 的添 加样 品中 ， 以目 标物 定量 离子 （对 ） 峰面积 值(Y)为 纵坐 标、 目 标物的 浓度(C)为横 坐标进 行线 性回 归， 得线 性方程 。 根据案件 样 品中 目标 物的 峰面积 值， 按公 式(1)计算出 案件 样品

27、中目 标物 的含量 。 b a Y C (1) 式中： C 案件 样 品中 目标 物 的 含量， 单位 为微 克每 毫升( g/mL)或 微克 每克(g/g) ； Y 案件 样品 中 目 标物 的 峰面积 值； a 线性 方程 的截 距 ； b 线性 方程 的斜 率。 7.4.3 外标- 单点 校正 法 根据案件 样品 和 添加 样品 中 目标 物 的 峰面 积值 ，按 公式(2)计 算出 案件 中目标物 的含量 。 A c A C (2) 式中： C 案件 样 品中 目标 物 的 含量， 单位 为 微 克每 毫升( g/mL)或 微克 每克(g/g) ； A 案件 样 品中 目 标物 的 峰

28、面积 值； A 添加 样品 中 目 标物 的峰面 积 值 ； c 添加 样品 目标 物 的 含 量，单 位为 微 克 每毫 升( g/mL)或 微克 每克(g/g) 。 7.4.4 计算相 对相 差 案件样 品同 时平 行测 定两 份，双 样相 对相 差按 公式(3) 计算 ： % 100 2 1 C C C RD (3) 式中： RD 相对 相差(%) ； C 1 、 C 2 两份 案件 样品 平行定 量测 定的 结果 ，单 位 为微 克每 毫升(g/mL) 或 微克每 克( g/g) ； C 两 份案 件样 品平 行定 量测定 结果 的平 均值(C 1+ C 2)/2 ，单 位为 微克 每

29、毫 升( g/mL) 或 微克 每克( g/g)。 8 分析结 果评 价 定性分 析结 果评 价 8.1.1 阴性结 果评 价 阴性结 果评 价包 括 ： a) 如果案 件样 品中 未检 出目 标物， 添加 样品 中检 出目 标物， 则阴 性结 果可 靠； b) 如果添 加样 品中 未检 出目 标物， 则阴 性结 果不 可靠 ，应按 照第 6 章 的规 定 重 新提取 检验 。 8.1.2 阳性结 果评 价 阳性 结 果评 价包 括： a) 如果案 件样 品中 检出 目标 物且空 白样 品无 干扰 ，则 阳性结 果可 靠； b) 如果空 白样 品亦 呈阳 性， 则阳性 结果 不可 靠， 应按

30、照第 6 章的 规定 重新 提取 检验 。 定量分 析结 果评 价 SF/T 0114 2021 7 两份案 件样 品的 相对 相差 不超过20% （ 腐败 检材 不超 过30%） 时， 结 果按 两份 案件 样品的 平均 值计 算 ， 否则应 重新 测定 。 SF/T 0114 2021 8 附录A （资料 性） 血液、 尿液 和组 织中 吗啡 、O 6 - 单乙 酰吗 啡和 可待 因 的检出 限 血液、 尿液 和组 织中 吗啡 、O 6 - 单乙 酰吗 啡和 可待 因 的检出 限见表A.1 。 表A.1 血液、 尿液 和组 织中 吗啡 、 O 6 - 单乙 酰吗 啡和 可待 因 的检出 限 样品 成分 GC-MS 检出限 g/mL 或 g/g LC-MS/MS 检出限 g/mL 或 g/g 尿液、血液 O 6 - 单乙酰吗啡 0.1 0.01 吗啡 0.1 0.01 可待因 0.1 0.01 组织 O 6 - 单乙酰吗啡 0.2 0.02 吗啡 0.2 0.02 可待因 0.2 0.02