DB32 T 3762.12-2021 新型冠状病毒检测技术规范 第12部分：药物体外抗病毒效果测定.pdf

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1、 ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.12 2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 12 部分：药物体外抗病毒效果测定 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 12: In vitro determination of antiviral effect of drugs 2021 - 11 - 04 发布 2021 - 12 - 04 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.12-2021 I 前 言 DB32/T 3762新型冠状 病毒检测技术规范

2、目前分为以下部分 ： 第 1部分：生物样本采集、运输和保存； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样 本 检测与评估； 第 8部分：物体表面检测与评估； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估 ； 第 10部分：微量血清中和试验 ； 第 11部分： 全基因组 高通量 测序 ； 第 12部分： 药物体外抗病毒效果 测定 。 本 文件 为 DB32/T 3762 的第 12部分。 本 文

3、件 按照 GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。 本 文件 由江苏省卫生健康委员会提出。 本 文件 由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本 文件 起草单位：江苏省疾病预防控制中 心、 江苏省人民医院 、 江阴市疾病预防控制中心、 南通市 疾病预防控制中心 。 本 文件 主要起草人： 葛以跃、崔仑标、 朱宝立、 迟莹、吴斌、吴涛、朱小娟 、 乔乔、赵康辰 、 刘根 焰、 张宏宾 、 张伟 。 DB32/T 3762.12-2021 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 12 部分 ： 药物体外抗病毒效果 测定 1 范围 本 文件 规定了 新型冠状病毒 药物体外抗病毒效果 测定 环境与设施、设备

4、与耗材、试剂与材料、 技术 要求、 操作步骤和清场与消毒。 本 文件 适用于新型冠状病毒 药物体外抗病毒效果 测定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本 文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册 中华人民共和国国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文

5、件 。 3.1 细胞病变效应 cytopathic effect， CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引 起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体， 乃至细胞裂解等。 3.2 感染复数 multiplicity of infection， MOI 感染时病毒和细胞数量的比值 。 3.3 半最大效应浓度 half-maximal effective concentration， EC50 能引起 50%最大效应的 药物 浓度。 3.4 半数细胞毒性浓度 Half-cytotoxic con

6、centration， CC50 对半数细胞 产生毒性作用 的药物 浓度 。 3.5 DB32/T 3762.12-2021 2 最大无毒浓度 maximal atoxic concentration， TC0 不引起细胞毒性的最大药物浓度 3.6 选择指数 selectivity index， SI 为判断药物效果的安全范围， SI=CC50/EC50， 选择指数越大 ， 药物的 安全范围越大。 4 环境与设施 4.1 实验室 资质及级别要求 应符合 新型冠状病毒实验室生物安全指南 的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定等 实验操作应当在生物安全三级实验室 （ BSL-3） 的生物安全柜

7、内进行。 使用病毒培养物提取核酸，裂解 剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比 照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。 实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准， 取得开展相应活动的资质。 病毒核酸 荧光 PCR检测程序 可 参照 DB32/T 3762.3进行 。 4.2 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应 经过 生物 安全培训 ， 操作活病毒人员 应 取得 BSL-3实验 室进入资质和相关实验 活动 上岗证 。操作人员 在健康状态良好的情况下经实验室主任批准后方可开展活动 ， 应 根据 新型冠状病 毒实验室生物安全指南 要

8、求 ，按照 BSL-3个人防护的要求进行防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、倒置显微镜、 涡旋振荡器、 水浴或金属浴、 冰箱、 CO2培养箱 、 离心机、 核酸提取仪 、 荧光定量 PCR仪 、 微量移液器 等 。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、 医用 防护服、一次性 PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套 、 带滤芯 Tip头、一次性平皿、 EP管、 96孔细胞培养板 、 96孔 PCR反应板 等。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 Hanks 溶液（每毫升含青霉素 、链霉素各 2000 单位） 6.1.2 DMEM 培养液（含 10

9、%胎牛血清）。 6.1.3 DMEM 维持液（含 2 %胎牛血清）。 6.1.4 消化液 （ 0.25 %胰酶和 0.025 % EDTA-Na2 混合液）。 6.1.5 核酸提取试剂盒 。 6.1.6 新型冠状病毒荧光 PCR 检测试剂盒。 DB32/T 3762.12-2021 3 6.2 材料 6.2.1 新型冠状病毒培养物 。 6.2.2 待检 药物 和 阳性对照 药物（瑞德西韦） 。 6.2.3 非洲绿猴肾传代细胞（ VERO-E6）。 7 技术要 求 7.1 病毒滴度质控： 确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒 毒株滴度，应至少有三次 独立的 滴度水平测定结果。 7.2 效果指标选

10、择： 药物体外抗病毒效果 可通过 观察 病毒致 CPE、 细胞活性染色 、 病毒噬斑减 少试验、 病毒抗原测定、 病毒 核酸 测定 等 方法 来判断， 本文件 通过 病毒核酸 测定 来评价 药物体 外抗病毒效果 。 7.3 毒性测定方法： 药物 对细胞的 毒性测定 可根据 药物特点选用 细胞病变观察 或细胞活性染色 （中性红、 MTT 或 CCK-8 等 染色后测 OD 值） 的方法进行 。 7.4 预处理要求： 如果待测药物是 中药 煎剂， 必须进行无菌过滤 以 去处药液沉渣， 以免影响结 果 观察 。 8 操作步骤 8.1 药物 对细胞的 毒性测定 8.1.1 将实验所需细胞 于 96 孔

11、培养板中 置 37 5 % CO2 培养箱培养至单层 ，覆盖度 80%左右 ，弃掉 细胞培养液。 8.1.2 待检 药物 稀释 ： 将待检药物用 细胞培养液 做倍比稀释， 使其稀释度分别为 原液 （ 选定 浓度 ） 、 1:2、 1:4、 1:8、 1:16、 1:32、 1:64、 1:128， 1:256， 1:512， 每完成一个一稀释度必须更换吸头，每个稀释 度溶液需要反复吹打混匀 。 8.1.3 分别取 200 l不同稀释倍数的待检药物 及 相同条件 稀释的 药物溶剂（如 DMSO） 滴加于细胞培 养孔中， 每一稀释度接种 4 孔 ， 置 37 5% CO2 培养箱中培养 。 8.1

12、.4 结果观察： 显微镜下逐日观察 并记录 CPE 结果， 直至药物对细 胞的毒性不再继续进展时判定结 果， 计算待检药物的 最大 无毒浓度 （ TC0） 和半数细胞毒性浓度 （ CC50） 。 8.2 药物抗病毒效果测定 8.2.1 将实验所需细胞 于 96 孔培 养板中置 37 5 % CO2 培养箱培养至单层，弃掉细胞培养液。 8.2.2 待检 药物稀释：将待检药物 选用最大无毒浓度， 用 DMEM 维持液做倍比稀释， 使其稀释度分 别为 原液 （ 最大无毒浓度 ） 、 1:2、 1:4、 1:8、 1:16、 1:32、 1:64、 1:128， 每完成一个一稀释度必须更换 吸头，每个

13、稀释度溶液需要反复吹打混匀 。 8.2.3 阳性对照药物稀释：将阳性对照药物（瑞德西韦）从 10M 原始 浓度开始，按 照和 待检药物 相 同 的 稀释 方法进行倍比稀释。 8.2.4 分别取 50 l不同稀释倍数的待检药物 或阳性对照药物 滴加于细胞培养孔中，每一稀释度接种 3 孔 ， 同时设立 病毒对照 （不加药物） 和细胞对照（ 不加药物、不加病毒 ） ， 置 37 5% CO2 培养箱中培 养 1 h。 8.2.5 将 药物预处理后的 细胞、病毒、 药物、 试剂和耗材一次性带入 BSL-3 核心区。 DB32/T 3762.12-2021 4 8.2.6 在 待检药物组、阳性对照药物组

14、 和 病毒对照组 的 细胞 孔中加入 新型冠状 病毒 （ 2 l/孔 ， 0.02 MOI） ， 置 37 5% CO2 培养箱 中培养 吸附 1 h。 8.2.7 弃培养上清 ， 以 Hanks 液 洗涤 细胞 2 次后加入含 有对应 不同浓度药物的 DMEM 维持液 ， 病毒 对照组和 细胞对照 组 加 不含药物的 DMEM 维持液 ， 置 37 5% CO2 培养箱 中 培养 48 h。 8.2.8 病毒灭活 与 核酸提取 ： 培养结束后， 在倒置显微镜下观察 CPE，并记录结果 ； 将培养上清 加入 核酸提取 试剂 的裂解液中 ， 混匀后 按照核酸提取试剂盒 和 核酸提取仪操作说明进行

15、 核酸提取 。 8.2.9 核酸检测 ： 参照 DB32/T 3762.3 进行 。 8.2.10 结果 计算 ： 根据核酸检测获得的 CT 值 ， 计算 不同药物浓度下病毒被药物抑制的百分比 （ %） ， 计算公式为 （ 1-2- CT） 100 （ 其中 CT=待检药物 组 CT 值 -病毒 对照组 CT 值 ） 。 以病毒被抑制的 百分比为纵坐标，药物浓度的对数值为横坐标，进行 Logistic 曲线拟合 （四参数） ，计算 待检 药物 和 阳 性对照药物 的 EC50 值 ，进一步计算 待检 药物的选择指数 SI（ CC50 / EC50） 。 8.2.11 质控要求 及 结果 分析

16、： 正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现 CPE 变化 ， 原始浓度的 阳性对照药物 能够阻止 CPE 的 产生。 通过比较 待检药物 和 阳性对照药物 的 EC50 值 ，结合待 检药物的 SI 值， 评估其 体外抗病毒效果 。 9 清场与消毒 9.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75 乙醇擦拭 外表面后，移出生物安全 柜。 9.2 将实验过程产生的所有污染材料经 121 ， 30 min 高压消毒灭菌处理。 9.3 用新鲜配制的 有效氯 5500 mg/L 的 含氯消毒液 擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不 要擦拭顶棚，作用 后 用清水擦拭以除去残余消毒液 ， 关闭生物安全柜，紫外灯消毒 30 min。 9.4 按照 正确的脱卸顺序 在指定 区域 脱卸个人防护用品， 退出 生物安全实验室 ， 填写相关实验 记录。 _