DB34 T 3650-2020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf

《DB34 T 3650-2020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB34 T 3650-2020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf（10页珍藏版）》请在麦多课文档分享上搜索。

1、ICS 65.150 B 52 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36502020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of residues of nitrofuran metabolites in aquatic Products ELISA method 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 2020 - 07 - 22 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 36502020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省水产技术推广总站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委

2、员会归口。 本标准起草单位：安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、宣城市念念 虾稻轮作专业合作社、安徽省水产技术推广总站、合肥市畜牧水产技术推广中心、北京柏奥泰科技有限 公司、合肥金荣生态农业有限公司。 本标准主要起草人：孙德祥、陈洪周、周作友、吴敏、金家红、何广、李瑞、卞红正、许世富、张 武庆、姚杰、李先锋、桂淦、郭恒心、魏泽能、荣朝振、刘传涛、魏涛、钱之云、王婷、刘卫芳、王振、 何超、范希芹、李珺、陈恩全。 DB34/T 36502020 1 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了水产品中四种硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫

3、吸附法的原理、 试剂与材料、 仪器和设备、试样制备与保存、测定方法、检测限、准确度和精密度、结果确证。 本标准适用于水产品中呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物残留 量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20752 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联 质谱法 GB/T 30891 水产品抽样规范 农业部 1192号

4、公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范 3 原理 试样经衍生化、提取出残留的硝基呋喃代谢物，分别在四种不同的硝基呋喃代谢物检测试剂盒中测 定。试样中残留的硝基呋喃代谢物、HRP 酶标记抗原共同竞争板上的抗体，加TMB底物后的颜色与试样 中残留的硝基呋喃代谢物的含量成反比，用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度值，建立标准曲线，得到对 应硝基呋喃代谢物浓度，乘以最终试液体积，除以最终试样质量，即得出含量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 乙酸乙酯：色谱纯 4.2 正己烷：色谱纯 4.3 盐酸溶液1 mol/L：取8

5、.3 ml 的36盐酸溶液溶于水中并定容到 100 ml。 4.4 磷酸氢二钾溶液0.1 mol/L：称取17.4 g 的无水磷酸氢二钾溶于水中并定容到 1000 ml。 4.5 氢氧化钠溶液1 mol/L：称取 4 g的氢氧化钠，溶于水中并定容到 100 ml。 4.6 硝基呋喃类代谢物测定试剂盒 包括：呋喃唑酮代谢物（AOZ）测定试剂盒、呋 喃它酮代谢物（AMOZ）测定试剂盒、呋喃西林 代谢物(SEM)测定试剂盒、呋喃妥因代谢物(AHD)测定试剂盒。 组成参见附录 A。 4.6.1 呋喃唑酮代谢物（AOZ）标准系列工作液（ng/mL）：0，0.02， 0.06，0.18，0.54，1.62

6、； DB34/T 36502020 2 4.6.2 呋喃它酮代谢物（AMOZ）标准系列工作液（ng/mL）：0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4； 4.6.3 呋喃西林代谢物(SEM)标准系列工作液（ng/mL）：0，0.02 5，0.1，0.4，1.6，6.4； 4.6.4 呋喃妥因代谢物(AHD)标准系列工作液（ng/mL）：0，0.02 5，0.1，0.4，1.6，6.4； 4.6.5 样品提取液：将水与试剂盒中 10浓缩提取液，按 19 的比例混合配置。 4.6.6 衍生化试剂：试剂盒自带 50 mmol/L 的2-硝基苯甲醛。 4.6.7 洗液：将水与试剂盒中 20浓缩洗液

7、，按 1：19的比例混合配制。 4.6.8 TMB 底物。 4.6.9 终止液。 5 仪器和设备 5.1 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 5.2 分析天平： 0.01g。 5.3 组织捣碎机。 5.4 漩涡仪。 5.5 恒温振荡器。温控范围：室温100，温控精度：0.5 5.6 离心机：离心力大于 4500 g。 5.7 氮吹仪：温控范围：室温100 5.8 恒温培养箱：温控范围：060，温度均匀度：0.5 5.9 可调移液器 单道 20 L200 L、100 L1000 L、500 L5000 L； 八道 50 L300 L。 6 试样制备和保存 6.1 试样制备 水产品按 GB/T

8、30891 的规定执行；水产苗种按农业部 1192号公告-1-2009 的规定执行。 采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。 取均质后的供试样品，作为供试试样。 取均质后的空白样品，作为空白试样。 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。 6.2 试样保存 于 -18条件下避光保存，保存期 6 个月。 7 测定方法 7.1 操作条件 所有操作应在 2025室温下进行。AOZ、AM OZ、SEM 和 AHD 测定试剂盒及所有试剂，使用前 应提前 60 min 以上取出，回升至室温后方可使用。 7.2 试样提取和净化 DB34/T 36502020 3

9、称取 1 g 0.02 g 试样置于 50 mL 离心管中，加入 0.5 mL 样品提取液（4.6.5）、3.5 mL 水、 0.5 mL 盐酸溶液（4.3）和 80 L 衍生化试剂（4.6.6），剧烈振荡 1 min，置于恒温振荡器中 60 避光振荡 3 h 或 37 避光振荡 16 h， 加入 5 mL 磷酸氢二钾溶液 （4.4） ， 0.4 mL 氢氧化钠溶液 （4.5） ， 涡旋 30 s ，加 6 mL 乙酸乙酯（4.1），涡旋振荡 1 min，离心力 4000 g 离心 15 min.。取出 3 mL 的上清液（相当于含 0.5 g 原始试样）到另一个 5 mL 离心管中，于 60

10、氮气吹近干。加 2 mL 正己 烷（4.2）溶解干燥物，加 1 mL 样品提取液（4.6.5）充分混合振荡 1 min，离心力 4500 g 下离心 10 min，去除正己烷层和中间相，下清液用作试液。 此最终试液体积（v）为 1 mL，所代表的最终试样质量（m）为 0.5 g。 7.3 酶联免疫测定 7.3.1 测定步骤 将测定需要的微孔条插入板架（标准工作液、试液和空白样及质控样分别作平行试验测定），记录 相应的位置。在每孔中，加入 100 L 标准工作液或 7.2 中的试液，50 L 酶标抗原，轻敲微孔板边 缘混匀 1 min，盖上板膜，放入恒温培养箱中于 22.52.5避光孵育 30

11、min；取出酶标板，微孔 向下甩出液体， 每孔加入 250 L 洗涤液 （4.6.7） ， 轻敲酶标板边缘混匀 15 s 后甩出液体， 重复 3 次， 在吸水纸上拍打，完全去除孔中液体。每孔加入 100 L TMB 底物（4.6.8），盖上板膜，放入恒温培 养箱中于 22.52.5避光孵育 20 min 后，加入 100 L 终止液（4.6.9），轻轻振荡混匀，用酶 标仪于 450 nm 处测定吸光度值(读数前，使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。 注1： 不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有差别，应严格按说明书要求规范操作。 注2： 呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋

12、喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)，应分别 用对应的酶联免疫检测试剂盒测定。 7.3.2 空白试验 除不称取试样外，均按 7.2 至 7.3.1 步骤进行。 7.4 结果计算 7.4.1 百分吸光率的计算 标准品或样品的百分吸光率按式（1）计算，百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均 值（双孔）除以 0 浓度标准工作液的吸光度值，再乘以 100，见式(1)： 相对吸光度值 A()= 0 B B 100 . (1) 式中： A标准工作液或试液的百分吸光率，； B非 0 浓度标准工作液或试液的平均吸光度值，； B00 浓度标准工作液（ ng/mL）的平均吸光度值，。 7.4.

13、2 标准曲线的绘制与计算 以相对吸光度值()为纵坐标，标准点浓度（ng/mL）为横坐标建立标准曲线。从校正曲线算出对 应的试样中硝基呋喃类代谢物浓度（c），再乘以最终试液体积（v），除以最终试样质量（m），即可 得出试样中硝基呋喃类代谢物残留量的结果，按式(2)计算： DB34/T 36502020 4 X=c m v 1000 1000 . (2) 式中： X硝基呋喃类代谢物含量，单位为微克每千克（ g/kg）； c从校正曲线算出试样中的硝基呋喃类代谢物浓度（ng/mL）； v检测液最终试液体积，单位为毫升（mL）； m检测液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 计算结果应扣除空白值。 注

14、： 结果保留三位有效数字。 7.5 质量控制 7.5.1 质控要求 每一批测定均应进行平行试验、空白试样测定和空白添加测定。 7.5.2 质控方式 7.5.2.1 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、试样溶液、空白及质控溶液应进行两个平行试验测定。 7.5.2.2 空白试样测定 测定结果应为阴性。 7.5.2.3 空白添加试样测定 用空白试样添加硝基呋喃代谢物标准溶液，添加浓度水平为试剂盒检测限和相关产品的 0.5 g/kg 或最大残留限量值。 8 检测限、回收率和精密度 8.1 检测限 本方法中 AOZ、AMOZ、SEM 和 AHD 的检测限均为 0.05 g/kg。 8.2 回收率 AM

15、OZ、SEM 和 AHD 空白试样中添加 0.05 g/kg5 g/kg，AOZ 空白试样中添加 0.05 g/kg1.5 g/kg，回收率范围为 60120。 8.3 精密度 本方法的变异系数均10。 9 结果确证 如样品中硝基呋喃代谢物残留量的测定值0.5 g/kg时，应按 GB/T 20752 进行确证。 DB34/T 36502020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 硝基呋喃代谢物酶联免疫测定试剂盒 A.1 呋喃唑酮代谢物（AOZ）测定试剂盒 28的温度下储存。 注： 如果超过 3 个月不使用试剂盒，应将酶标抗原放置 -20或者冰冻保存。 试剂盒包括： 已包被的酶标板(AOZ-

16、coated Plate)（可拆式） . . 128 孔 标准液(Standards)（ng/mL：0，0.02， 0.06，0.18，0.54，1.62） . . 61.8 mL 回收用10 ng/mL (Sp iking) . 1.8 mL AOZ酶标抗原(HRP-Con jugate) . 6 mL 10浓缩提取液 (Extracti on buffer) . 25 mL 20浓缩洗液(Washing S olution) . 28 L 终止液(Stop Buff er) . 14 mL TMB底物(TMB Substrate) . . 12 mL 50 mM 2-硝基苯甲醛(2-Nit

17、ro benzaldehyde) . 1.8 mL A.2 呋喃它酮代谢物（AMOZ）测定试剂盒 28的温度下储存。 注： 如果超过 3 个月不使用试剂盒，应将酶标抗原放置 -20或者冰冻保存。 试剂盒包括： 已包被的酶标板（AMOZ-coated Plate)（可拆式） . 128 孔 标准液(Standards)（ng/mL：0，0. 025，0.1，0.4，1. 6，6.4） . . 61.8 mL 回收用10 ng/mL (Sp iking) . 1.8 mL AMOZ酶标抗原(HRP-Conjugate) . . 6 mL 10浓缩提取液 (Extracti on buffer) .

18、 25 mL 20浓缩洗液(Washing S olution) . 28 L 终止液(Stop Buff er) . 14 mL TMB底物(TMB Substrate) . . 12 mL 50 mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitro benzaldehyde) . 1.8 mL A.3 呋喃西林代谢物(SEM)测定试剂盒 28的温度下储存。 注： 如果超过 3 个月不使用试剂盒，应将酶标抗原放置 -20或者冰冻保存。 试剂盒包括： 已包被的酶标板（SEM-coated P late)（可拆式） . 128 孔 标准液(Standards)（ng/mL：0，0. 025，0.1，0.4，1.

19、 6，6.4） . . 61.8 mL DB34/T 36502020 6 回收用10 ng/mL ( Spiking) . 1.8 mL SEMZ酶标抗原(HRP-Conjugate) . 6 mL 10浓缩提取液 (Extracti on buffer) . 25 mL 20浓缩洗液(Washin g Solution) . 28 L 终止液(Stop Buffer) . 14 mL TMB底物(TMB Substrate) . 12 mL 50 mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitro benzaldehyde) . 1.8 mL A.4 喃妥因代谢物(AHD)测定试剂盒 28的温度下储存。

20、 注： 如果超过 3 个月不使用试剂盒，应将酶标抗原放置 -20或者冰冻保存。 试剂盒包括： 已包被的酶标板(AHD)-coated Plate)（可拆式） . . 128 孔 标准液(Standards)（ng/mL：0，0. 025，0.1，0.4，1. 6，6.4） . . 61.8 mL 回收用10 ng/mL ( Spiking) . 1.8 mL AHD)酶标抗原(HRP-Conjugate) . 6 mL 10浓缩提取液 (Extracti on buffer) . 25 mL 20浓缩洗液(Washin g Solution) . 28 L 终止液(Stop Buffer) . 14 mL TMB底物(TMB Substrate) . 12 mL 50 mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitro benzaldehyde) . 1.8 mL _