SN T 5170-2019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 51702019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲 肾上腺素的测定 Determination of adrenaline and noradrenaline in animal-origin foodstuffs for export 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布 ICS 67.050 C 53 I SN / T 51702019 前 言 本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国武汉海关、武汉食品
2、化妆品检验所、湖北省食品质量安全监 督检验研究院。 本标准主要起草人:江小明、王鹏、叶诚、江丰、陈丹、赵晓亚、王晗、罗静、王振华、詹承勇。 1 SN / T 51702019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定 1 范围 本标 准规定了出口动物源食品中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的液相色谱测定方法和液相色谱 - 质谱 / 质谱确证方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶、鸡蛋中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的测定,其他 食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(
3、包括所有的修改单)适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 猪肉 、牛肉、羊肉、鸡蛋中肾上腺素和去甲肾上腺素经焦性没食子酸 - 乙二胺四乙酸二钠溶 液提取,三氯甲烷去蛋白,乙腈饱和正己烷溶液除脂;牛奶用高氯酸溶液提取。试样用阳离子固 相萃取小柱净化后,经液相色谱仪测定,基质添加标准曲线外标法定量,阳性样品采用液相色谱 - 质谱 / 质谱仪进行定性确证。 4 试剂和材料 除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1甲醇(CH 3 OH,CAS 号:67-56-1):色谱纯。 4.2乙腈(CH 3 CN,CAS 号
4、:75-05-8):色谱纯。 4.3甲酸(HCOOH,CAS 号:64-18-6):色谱纯。 4.4正己烷(C 6 H 14 ,CAS 号:110-54-3)。 4.5三氯甲烷(CHCl 3 ,CAS 号:67-66-3)。 4.6磷酸(H 3 PO 4 ,CAS 号:7664-38-2)。 4.7高氯酸(HClO 4 ,CAS 号:7601-90-3):含量 70% 72%。 4.8磷酸二氢钾(KH 2 PO 4 ,CAS 号:7778-77-0)。 4.9乙酸铵(CH 3 COONH 4 ,CAS 号:631-61-8)。 4.10焦性没食子酸(C 6 H 6 O 3 ,CAS 号:87-
5、66-1)。 4.11乙二胺四乙酸二钠(C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 ,CAS 号:139-33-3)。 4.12肾上腺素标准物质(C 9 H 13 O 3 N,CAS 号:51-42-3):纯度大于等于 95%。 4.13去甲肾上腺素标准物质(C 8 H 11 NO 3 ,CAS 号:51-41-2):纯度大于等于 95%。 4.14高氯酸溶液(pH=2.00.2):吸取约 0.4 mL 高氯酸(4.7)至 1 L 水中,配制成 pH=2.00.2 的高氯酸水溶液。 4.15试样提取液:准确称取 1.26 g 焦性没食子酸(4.10)、1.86 g 乙二胺四乙酸二钠(4.11
6、),加 2 SN / T 51702019 入 950 mL 水,加 50 mL 乙腈(4.2)混合均匀。 4.16乙腈饱和正己烷:量取 80 mL 正己烷(4.4)于 100 mL 分液漏斗中,加入适量乙腈(4.2)后, 剧烈振摇,待分配平衡后,弃去乙腈层即得。 4.17磷酸二氢钾 - 磷酸水溶液(pH=4.0):准确称取 2.72 g 磷酸二氢钾(4.8),用水定容至 1 L, 用磷酸(4.6)调节 pH 至 4.0。 4.180.1% 甲酸甲醇溶液:准确移取 1 mL 甲酸(4.3),用甲醇(4.1)定容至 1 000 mL。 4.19洗脱液:移取 2 mL 甲酸(4.3)加入 100
7、mL 的乙腈 - 水溶液(85 : 15,体积比)中。 4.20100 mmol / L 乙酸铵溶液:准确称取 3.85 g 乙酸铵(4.9),用水溶解,定容至 500 mL。 4.2140 mmol / L 乙酸铵溶液:准确称取 1.54 g 乙酸铵(4.9),用水溶解,定容至 500 mL。 4.220.5 mmol / L 乙酸铵溶液:准确称取 0.038 5 g 乙酸铵(4.9),用水溶解,定容至 1 L。 4.23标准储备液:准确称取适量的肾上腺素标准物质(4.12)、去甲肾上腺素标准物质(4.13),均 精确至 0.000 1 g,用 0.1% 甲酸甲醇溶液(4.18)溶解,配制成
8、浓度为 1 000 mg / L 的标准储备液,-18 条件下避光保存,有效期 3 个月。 4.24混合标准中间溶液:分别准确移取 5.0 mL 肾上腺素、去甲肾上腺素的标准储备液(4.23)至 100 mL 棕色容量瓶中,用 0.1% 甲酸甲醇溶液(4.18)稀释至刻度,配制成浓度为 50.0 mg / L 的标准 中间溶液,于 -18 条件下避光保存,有效期 1 个月。 4.25基质混合标准工作溶液:将混合标准中间溶液(4.24)用磷酸二氢钾 - 磷酸水溶液(4.17) 稀释成浓度为 2.50 mg / L 50.0 mg / L 的标准系列溶液,称取与试样基质相应的阴性样品 5 g,加入
9、 标准系列溶液 100 L,与试样同时进行提取和净化,得到浓度分别为 125 g / L2 500 g / L 的基质混 合标准工作溶液。 4.26阳离子固相萃取(SPE)小柱:填料为 N- 乙烯基吡咯烷酮 - 二乙烯苯共聚物基质 -COOH 6 mL(150mg)或性能相当者。使用前依次用 6 mL 甲醇(4.1)、6 mL 水对柱子进行活化。 4.27微孔滤膜:通用型,0.22 m。 5仪器与设备 5.1液相色谱仪:配荧光检测器。 5.2液相色谱 - 质谱 / 质谱仪:配电喷雾离子源(ESI)。 5.3组织捣碎机。 5.4涡旋混合器。 5.5电子分析天平:感量为 0.000 1g 和 0.
10、01g。 5.6高速冷冻离心机:转速不低于 8 000 r / min。 5.7氮气吹干仪。 5.8pH 计。 6试样制备与保存 6.1试样制备 6.1.1猪肉、牛肉、羊肉 猪肉、牛肉、羊肉各约 500 g,放入组织捣碎机均质,充分混匀,均分成 2 份,分别装入清 洁容器内,并标明标记。 3 SN / T 51702019 6.1.2鸡蛋 取 16 枚新鲜鸡蛋(约 1 kg),洗净、去壳后充分混匀,均分成 2 份,分别装入清洁容器内, 并标明标记。 6.1.3牛奶 将牛奶从冰箱中取出,放置至室温、摇匀,备用。 制样操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样保存 猪肉、牛
11、肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 以下条件下保存;牛奶试样置于 0 4 条件 下保存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋 称取试样 5 g (精确到 0.01 g)于 50 mL 具塞离心管中,加入 10 mL 试样提取液(4.15),涡 旋提取 1 min,加入 5 mL 三氯甲烷(4.5),涡旋混匀 30 s,以 8 000 r / min 的转速离心 10 min 后,取全部上清液于另一 50 mL 离心管中,加入 5 mL 乙腈饱和正己烷(4.16),涡旋混匀 30 s, 以 8 000 r / min 的转速离心 3 min,收集下层清液,用 100 mmol /
12、 L 乙酸铵溶液(4.20)定容到 25 mL,待净化。 7.1.2牛奶 称取试样 5 g(精确到 0.01 g)于 50 mL 具塞离心管中,加入 20 mL 高氯酸溶液(4.14),静置 20 min,于 4 经涡旋提取 1 min,以 8 000 r / min 的转速离心 10 min,取出上清液,用 100 mmol / L 乙酸铵溶液(4.20)定容到 50 mL,待净化。 7.2净化 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋样品取7.1.1中待净化溶液12.5 mL过SPE小柱(4.26);牛奶样品取 7.1.2 待净化溶液 25 mL 过 SPE 小柱(4.26)。控制流速为 1 mL / mi
13、n 2 mL / min,再依次用 5 mL 40 mmol / L 乙酸铵溶液(4.21)和 5 mL 甲醇(4.1)淋洗柱子,经真空抽干,用 5 mL 洗脱液(4.19) 洗脱,控制流速为 1 mL / min 2 mL / min,收集洗脱液,用氮气吹至干,用磷酸二氢钾 - 磷酸水 溶液(4.17)定容至 1 mL,过 0.22 m 微孔滤膜(4.27),供液相色谱仪分析。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 7.3.1.1 色谱柱:C 18 色谱柱,250 mm4.6 mm(内径),粒径 5.0 m 或性能相当者。 7.3.1.2 柱温:35 。 7.3.1.3 流 动相:A 为磷酸二
14、氢钾 - 磷酸水溶液(pH=4.0)(4.17),B 为甲醇(4.1),梯度洗脱, 梯度洗脱条件见表 1。 4 SN / T 51702019 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0 97 3 5 97 3 10 35 65 15 35 65 15.1 97 3 7.3.1.4 柱流速:1 mL / min。 7.3.1.5 进样量:10 L。 7.3.1.6 检测器激发波长:285 nm。 7.3.1.7 发射波长:320 nm。 7.3.2定量测定 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与基质混合标准工作溶液相比 ,变化范围应在 2.5% 之
15、间。将基质混合标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱仪中,保留时间定性,测得待测物 峰面积。待测样液中肾上腺素、去甲肾上腺素的响应值均应在仪器检测的定量线性响应范围内。 肾上腺素、去甲肾上腺素的液相色谱图参见附录 A。 7.4液相色谱 - 质谱 / 质谱确证 7.4.1阳性样品的确证 对于液相色谱方法检出阳性的样品,采用液相色谱 - 质谱 / 质谱方法进行定性确证。 7.4.2液相色谱条件 7.4.2.1 色谱柱:C 18 色谱柱,50 mm2.1 mm(内径),粒径 1.7 m 或性能相当者。 7.4.2.2 柱温:35 。 7.4.2.3 流 动相:A 为 0.5 mmol / L 乙酸铵
16、溶液(4.22),B 为 0.1 % 甲酸甲醇溶液(4.18),梯度 洗脱,梯度洗脱条件见表 2。 表 2 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0 90 10 1.5 90 10 5.5 10 90 7 10 90 10 90 10 7.4.2.4 柱流速:0.25 mL / min。 7.4.2.5 进样量:10 L。 5 SN / T 51702019 7.4.3质谱条件 7.4.3.1 离子源:电喷雾离子源(ESI) 。 7.4.3.2 扫描方式:正离子扫描。 7.4.3.3 检测方式:多反应监测模式(MRM) 。 7.4.3.4 监测离子对
17、、定量离子对见表 3。 表 3 肾上腺素、去甲肾上腺素的监测离子对、定量离子对 被测物 监测离子对(m / z) 定量离子对(m / z) 肾上腺素 184.1 / 166.1 184.1 / 107 184.1 / 166.1 去甲肾上腺素 152.3 / 107 152.3 / 135 152.3 / 107 7.4.3.5 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求,参考质谱条件参见附录 B。 7.4.4定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和基质混合标准工作溶液,试样中目标化合物的保 留时间与基质混合标准工作溶液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5% 之内;定性离子对的
18、相 对丰度与浓度相当的基质混合标准工作溶液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表 4 的规定, 且每个定性离子的信噪比均 3,则可判断试样中存在相应的被测物。在上述仪器条件下,肾上 腺素、去甲肾上腺素的提取离子色谱图参见附录 C。 表 4 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % 50 2050(含) 1020(含) 10 允许的相对偏差 / % 20 25 30 50 7.5空白试验 除不加试样外,均按上述测定条件和步骤进行。 8结果计算和表述 采用基质匹配标准曲线定量,试样中肾上腺素、去甲肾上腺素的含量由液相色谱仪和液相色 谱 - 质谱 / 质谱仪的数据处理软件按式(1)计算,
19、计算结果应扣除空白值。 cV f X m = (1) 式中: X试样中被测组分的含量,单位为微克每千克( g / kg); c 从标准工作曲线得到的样液中被测组分浓度,单位为微克每升( g / L); V试样定容体积,单位为毫升(mL); f 试样的稀释倍数; 6 SN / T 51702019 m 试样称样量,单位为克(g)。 注:计算结果以重复性条件下获得的 2 次独立测定结果的算术平均值表示,保留 3 位有效数字。 9检出限、定量限和回收率 9.1检出限和定量限 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋、牛奶中肾上腺素、去甲肾上腺素的检出限为 50.0 g / kg,定量限 为 100 g / kg。 9
20、.2回收率 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋、牛奶中肾上腺素、去甲肾上腺素的添加水平和回收率数据参见附 录 D。 7 SN / T 51702019 附录A (资料性附录) 去甲肾上腺素和肾上腺素标准物质的液相色谱图 图 A.1 去甲肾上腺素、肾上腺素标准物质的液相色谱图(1 000 g / L) 注 : 去甲肾上腺素、肾上腺素标准品的保留时间分别为 2.525 min、2.930 min。 8 SN / T 51702019 附录B (资料性附录) a 质谱参考参数 1) B.1 离子源温度:150 。 B.2 毛细管电压:3 000 V。 B.3 脱溶剂气温度:500 。 B.4 脱溶剂气流速:80
21、0 L / h。 B.5 锥孔气流速:146 L / h。 B.6 肾上腺素、去甲肾上腺素的主要参考质谱参数见表 B.1。 1)非商业性声明:本标准中所列参数是在 Waters TQ-S 质谱仪完成的,此处列出试验用仪器型号仅是为了提供 参考,并不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号仪器。 表 B.1 肾上腺素、去甲肾上腺素的主要参考质谱参数 化合物名称 母离子(m / z) 子离子(m / z) 扫描模式 锥孔电压(DP) / V 碰撞气电压(CE) / eV 肾上腺素 184.1 166.1 * ESI + 25 8 107 18 去甲肾上腺素 152.3 107 * ESI +
22、 25 15 135 10 注: * 表示定量离子对。 9 SN / T 51702019 附录C (资料性附录) 标准物质的提取离子色谱图 图 C.1 肾上腺素标准溶液的提取离子色谱图(50 g / L) 图 C.2 去甲肾上腺素标准溶液的提取离子色谱图(50 g / L) a) a) b) b) 10 SN / T 51702019 附录D (资料性附录) 添加水平及回收率数据 表 D.1 肾上腺素和去甲肾上腺素在猪肉中的添加水平及其回收率 化合物 添加浓度 / ( g / kg) 回收率范围 / % 相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010 2 81.4108.0 11.5 2.00
23、10 2 80.792.3 4.8 1.0010 3 82.9107.2 10.1 去甲肾上腺素 1.0010 2 85.9107.4 8.8 2.0010 2 86.3105.6 7.0 1.0010 3 82.4106.7 9.1 表 D.2 肾上腺素和去甲肾上腺素在牛肉中的添加水平及其回收率 化合物 添加浓度 / ( g / kg) 回收率范围 / % 相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010 2 85.2103.7 8.3 2.0010 2 80.3108.0 11.2 1.0010 3 84.5107.2 8.5 去甲肾上腺素 1.0010 2 82.8104.5 8.6 2.0
24、010 2 82.7104.2 8.8 1.0010 3 80.298.3 6.8 表 D.3 肾上腺素和去甲肾上腺素在羊肉中的添加水平及其回收率 化合物 添加浓度 / ( g / kg) 回收率范围 / % 相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010 2 82.3106.2 9.1 2.0010 2 81.3108.4 12.1 1.0010 3 86.3104.5 7.0 去甲肾上腺素 1.0010 2 91.9106.6 5.5 2.0010 2 80.397.4 8.6 1.0010 3 92.2107.7 6.2 11 SN / T 51702019 表 D.4 肾上腺素和去甲肾上
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