DB63 T 454.5-2004 奶牛繁育技术规程.pdf

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1、I CS 备案号： 15208-2004 青 海 省 地 方 标 准 DB6 3 / T 4 5 4 . 5 2 0 0 4 奶牛 繁育技 术规程 Re g u l a t i o n o n m i l k - c o w f e e d i n g a n d m a n a g e m e n t 2 0 0 4 - 0 2 - 1 7 发布 2 0 0 4 - 0 4 - 0 1 实施 青 海 省 质 量 技 术 监 督局发布局发布局发布局发布 DB63 DB63/T 454.5 2004 I 目 次 前言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II 1 范围 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

3、 2 规范性引用文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4、 . . . . . . . . 1 4 奶牛的选择 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 育种方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 繁殖方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 繁殖技术 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 母牛妊娠检查 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 母牛的分娩与接产 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 附录 A （规范性附录） 奶牛冷冻精液人工授精技术操作规程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 附录 B （规范性附录） 奶牛胚胎移植技术操作规程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

8、DB63/T 454.5 2004 I I 前 言 为加快我省奶牛业的发展，提高奶牛质量 和奶牛繁育技术水 平，结合我省实 际情况，促进奶牛繁 育体系建设，特制定本规程。 本标准由青海省农牧厅提出。 本标准由青海省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：青海省畜牧兽医总站。 本标准主要起草人：王煜、焦小鹿、鲍守刚、戴海琦。 DB63/T 454.5 2004 1 奶牛繁育技术规 程 1 范围 本标准规定了奶牛选育、奶牛育种方案、 繁殖方法、繁殖技 术、母牛妊娠检 查、分娩与接产等技 术规程。 本标准适应于奶牛养殖业的饲养、管理和生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本

9、标准的条款。 凡 是注日期的引用文件， 其 随后所有 的 修改单 （ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然 而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研 究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 4143 牛冷冻精液 中华人民共和国种畜禽管理条例 中华人民共和国动物防疫法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 纯种繁育 purebreeding 指同品种内公母牛的交配繁殖。 3.2 杂交繁育 crossbreeding 指非纯种乳牛群内或不同品种间进行相互交配。 3.3 同期发情（同步发情） estrussynchroniz

10、aton 指通过激素或其他药物处理，人为地控制并调整群体母牛在一定时间内集中发情。 3.4 泌乳速度 milkingrate 指单位时间从乳房中排出的奶量称泌乳速度（也称排乳速度）。 4 奶牛的选择 应符合奶牛选育规程要求。 5 育种方案 5.1 选择适合的乳牛品种。 5.2 选择或购买最好的母牛。 5.3 制定达到理想指标的繁育方法。 5.4 乳牛群鉴定。 5.5 选择、培育理想公牛。 5.6 制定选配计划。 DB63/T 454.5 2004 2 5.7 建立严格选留、淘汰制度。 5.8 制定适宜的饲养管理方案。 6 繁殖方法 6.1 纯种繁育。包括近亲繁殖（品系繁育、嫡亲繁育）、远亲繁育

11、。 6.2 杂交繁育。包括经济杂交、引入杂交、级进杂交。 7 繁殖技术 7.1 繁殖管理 7.1.1 泌乳牛在成年母牛群中所占比例应达到 80% 。 7.1.2 初配及初产年龄 初配应在 14-17个月龄以内，初产应在 23-26月龄以内。 7.1.3 产后发情及配种时间 产后 50天内出现发情的母牛，达 产犊母牛群的 80%以上，发 情周期正常的母牛达 90%以上，则 属正 常 ； 产后配种时间根据母牛的产乳量，可适当提前或延迟，应在 60-90天配种。 7.1.4 产犊间隔（月） 应保持在 12个月，超过 13个月以上，则应研究改进缩短产犊间隔的技术措施。 7.1.5 繁殖记录与统计 7.

12、1.5.1 母牛配种登记。 7.1.5.2 母牛繁殖动态登记。 7.2 母牛发情鉴定方法 7.2.1 外部观察法 发情母牛表现精神不安， 敏 感， 尤其在清晨， 发 情母牛在运动场或牛舍不停走动。 观察时间最好 在 清晨。 7.2.2 阴道检查 将母牛保定好后用 0.1%高锰酸钾溶液浸湿毛巾清毒， 擦 洗外阴部， 并 将开膣器用 2% 5%来苏儿溶 液 清洗后，一手持开膣器，将开膣器横位慢慢从阴户插入阴道内，旋转 90度，检查母牛阴道和宫颈粘膜， 粘膜充血、肿胀程度、粘膜分泌量、色泽、粘稠度等判定。 7.2.3 直肠检查 用手通过母牛直肠壁， 触摸卵巢及卵泡的大小、 形 状、 变化等， 判断母

13、牛发情的阶段， 确定其发 情 情况。 7.3 母牛的异常发情 母牛的异常发情包括隐性发情、假发情、持续发情、不发情。 7.4 母牛配种 母牛发情持续时间为 18 小时左右，而母牛排卵时间多数发生在发情结束后 6-7小时。最适宜的 配 种时间，应掌握在发情末期至发情结束后 3-4小时为宜。 7.4.1 人工授精 采用良种奶牛的颗粒冻精或细管冻精配种，引进的冻精符合 GB4143牛冷冻精液要求。 7.4.2 人工授精操作 按照人工授精操作规程执行（附录 A ）。 7.4.3 输精 直肠把握深部输精。应符合奶牛人工授精技术操作规程要求。 7.5 胚胎移植 按照奶牛胚胎移植技术操作规程执行（附录 B

14、） 。 DB63/T 454.5 2004 3 8 母牛妊娠检查 8.1 妊娠检查的方法 外部观察、直肠检查、阴道检查。 8.2 早期妊娠检查 放射免疫测定法（ RIA）、眼球结膜血管变化诊断。 8.3 妊娠期 初产母牛怀孕期平均为 268 5 天，经产母牛为 278 5 天。 9 母牛的分娩与接产 9.1 接产准备 9.1.1 产房必须打扫干净，并用 2 火碱水喷洒消毒，然后铺上清洁干燥的垫草，冬季寒冷地区应注 意保暖。 9.1.2 接产人员必须用祖水洗净母牛的外阴部、肛门、尾根周围及臀部两侧的污物，并用 1 高锰酸 钾溶液擦洗消毒。 9.1.3 接产人员在接产前应洗净手臂，并准备好碘酒，酒

15、精或高锰酸钾等消毒药液，以便消毒犊牛脐 带。 9.1.4 准备长 2 3 米的细麻绳若干根，以备难产时牵引胎儿，同时，准备消毒过的石蜡油、食用油， 以备检查胎位或难产时润滑产道。 9.2 初生犊牛处理 9.2.1 犊牛出生后必须尽快用干纱布或毛巾消除犊牛口腔、鼻腔内的粘液，然后用消毒过的剪刀剪断 脐带 ( 距腹壁 10 厘米左右 ) ，挤去脐带内血液，并用 5 碘酒浸泡消毒，但不必包扎，以利脐带迅速干 燥和脱落。 9.2.2 脐带处理后，鉴别犊牛公母，称重、编号和登记犊牛卡片。 9.3 母牛产后护理 9.3.1 为消除母牛疲劳， 应 及时喂以微温麸皮粥 ( 汤 ) ， 其 喂量为 10 20

16、千克 ( 麸皮 50 克， 食盐 50 克 ， 碳酸钙 50 克 ) 。 这 有利于胎衣排出和帮助母牛恢复体力。 过 度疲劳的母牛， 可 注射一些樟脑或安那加 等 强心剂。 9.3.2 分娩后，应尽早驱使母牛站起，以减少出血。 9.3.3 母牛乳房和后躯部要及时洗净，并用来苏儿水消毒外阴部，更换垫草，以防细菌感染。 9.3.4 犊牛生后 3 12 小时，母牛胎衣一般自行脱落。胎衣排出后有时还从阴道中流出恶露，应用来 苏儿等药液擦洗消毒。如超过 24 小时，胎衣仍不脱落者，应由兽医进行处理。 9.3.5 产犊计划 全年均衡产犊。 4 8 月份尽量安排母牛产犊，这既有利于产犊，也可提高产乳量。 D

17、B63/T 454.5 2004 4 附 录 A （规范性附录） 奶牛冷冻精液人工授精技术操作规程 A.1 人工授精站 ( 点 ) 建设要求 A.1.1 配种站（点）应设在母牛密度大、易于集中、交通方便的地方。 A.1.2 操作室要向阳干燥，精液处理室要窗明台净，设置天棚、地板（水泥地坪）。 操作台在操作前 1 小时，用 75%酒精棉球消毒，地面每天操作前后都需擦拭干净。室内操作人员需穿工作服，非操作人员 严禁入内。 A.1.3 室内必须保持器械整洁、 无尘、 无烟、 无蝇、 无味、 不准存放损害精液的物品， 做到无菌操作 。 参配母牛要逐头登记繁殖及配种情况。应记清配种牛所在的乡、村、畜主及

18、品种、毛色、年龄等特征。 A.2 人工授精器械、用具的清洗和消毒 A.2.1 器械、用具存放 人工授精用的器械、 药品等， 须 放在清洁的橱柜内， 切忌和兽药械串混使用。 常用的器械、 药品 可 放在操作台上，用灭菌的双层纱布或白布盖好。 A.2.2 器械、用具清洗 各种器械用前 （ 后） ， 用 中性洗衣粉或 2%碳酸氢钠水洗刷除去油污， 再 用除去杂质的沉淀温开水 或 蒸馏水冲洗 2 3 遍。 A.2.3 玻璃、金属器械消毒 玻璃、金属器械在空气中控干后，可在 120 电热干燥箱内消毒 30分钟，也可用高压蒸气或煮沸消 毒 30分钟。无条件的地区可用 75%的酒精吸注和擦拭消毒，自然挥发和

19、酒精火焰烘干均可。 A.2.4 布类、冲洗液、解冻液消毒 必须高压蒸气或煮沸消毒。输精器的胶球、输精枪硬塑料外套等塑（橡）胶物品在清洗后，用 75% 酒精棉球擦拭，待酒精完全挥发后再用 2.9%柠檬酸钠冲洗液冲洗 3 遍备用，严防蒸煮，致使老化。 A.2.5 注射器、输精器消毒 注射器、输精器经宁檬配钠液冲洗后，用 75%酒精绵球擦 3 次备用。 A.2.6 输精器、输精枪使用要求 为防止疾病传染及其它污染， 一 支消毒冲洗后的输精器、 输 精枪的硬塑料外套， 只 准授配 1 头母牛 ， 用后立即清洗。 A.3 冷冻精液的处理 A.3.1 解冻 A.3.2 颗粒冻精解冻 A.3.2.1 解冻液

20、的配制 A.3.2.2 配方 1 2.9克柠檬酸钠加双重蒸馏水 100毫升。应配成溶液，过滤 3 遍，经高压蒸气或煮沸消毒 30分钟冷却 后，每 100毫升再添加青链霉素各 5 10万单位，分装于玻璃瓶内，保存于 4 冰箱或冷暗处备用。 A.3.2.3 配方 2 3 克葡萄糖、 1.4克柠檬酸钠、 加双重蒸馏水 100毫升。 应配成溶液， 过 滤 3 遍， 经高压蒸气或煮沸 消 毒 30分钟冷却后，每 100毫升再添加青链霉素各 5 10万单位，分装于玻璃瓶内，保存于 4 冰箱或冷暗 处备用。 A.3.2.4 配方 3 （脱脂鲜奶） DB63/T 454.5 2004 5 取新鲜牛奶， 用四层

21、纱布过滤， 装入灭菌烧杯内， 隔水煮沸 3 次， 每次待冷却后， 揭去乳皮， 每 100 毫升冷却后的奶液添加青霉素 10万单位，随配随用，防止变质。 A.3.3 冲洗液 可用 2.9%柠檬酸钠液。 A.3.4 解冻方法 采取高温水浴快速解冻， 温 度 35 40 。 在 消毒冲洗后的试管内， 注入 1 1.5毫升解冻液， 置 于 3 5 40 的水浴杯 （锅） 中， 当解冻液温度达水浴温时， 用预先冷过的长把镊子， 迅速取出冻精 1 2 粒， 投 入试管中轻轻摇晃，待 冻精融化至 1/2或 1/3时，迅 速将试管提离水浴面，仍 轻轻摇晃至全部融解后镜 检 、 待用。夹取 2 粒冻精，必须一次

22、完成，避免因第二次投放的冷打击，降低冻精的活力。 A.3.4.1 细管冻精解冻 用预冷后的长柄镊子将细管冻精从容器内夹出迅速放 入 38 2 的温水中直接浸泡解冻约 10 15 秒后取出水面，用无菌纱布 擦去细管上 面的水份， 用消毒过的 专用剪刀剪 去超声波热 合封口端， 镜检、待用。 A.3.4.2 冻精活力检查 用普通显微镜（ 400倍），在显微镜保温箱 38 40 的温度下进行。为准确评定精子成活的比例， 须定期用血球计算器检查。 即 先用 1%生理盐水做 20 倍稀释， 在 计算板上数出死亡精子数， 再用 3%生 理 盐水与第一次同倍稀释，杀死全部精子，数准确精子总数，二者之差就是活

23、精子数。 精子活率（ % ）活精子数 总精子数 100% 在显微镜下用肉眼观察，以视野内，每 10 个精子中有多少个正常精子呈直线前进运动状态者，即 为其解冻后活率。 A.3.5 精液解冻后的分装、保存和运输 解冻后精液需要送往异地输精母牛时，应按下列程序进行。 A.3.5.1 分装、保存 解冻后检查合格的颗粒精液， 可 用适当容量的试管盛装， 管 口用灭菌的玻璃纸棉塞塞紧， 棉 塞应 接 近精液面，以防震荡。 A.3.5.2 运输 将解冻后镜检合格的颗粒精液和细管精液用 6 层灭菌纱布包扎紧后，置于固定的容器内，直接送达 输精处。 A.4 母牛发情鉴定 A.4.1 外部观察 母牛接受试情牛或

24、其它母牛爬跨，或相互爬跨，可判定发情。 母牛外观表现站立不安、 哞叫、 张望、 弓腰举尾、 频尿， 外阴肿胀湿润， 阴道粘液潮红，有透明 粘 液流出（吊线）及食欲减退，泌乳量下降等状态，可判别母牛发情。 A.4.2 直肠检查 可用直肠触摸卵泡发育，进行发情鉴定。 A.4.3 乏情母牛处理 对生理和营养性造成乏情的母牛，可用生殖激素诱发催情配种。 A.4.4 患病母牛处理 患有生殖器官疾病的母牛，应根据不同病情，经治疗痊愈后，鉴情输精。 A.5 输精 A.5.1 授精方法和部位 A.5.1.1 外阴部消毒 DB63/T 454.5 2004 6 用 2%高锰酸钾液擦洗外阴， 再 用 2.9%柠檬

25、酸钠棉球擦拭阴唇和阴裂， 做 到外阴无粪便和污物。 输 精 器沾粘粪便后，应重用 2.9%柠檬酸钠棉球由前端向手握方向擦拭干净后再用。 A.5.1.2 输精部位 采用直肠把握子宫颈深部输精，将精液输在子宫颈深部或子宫体内。 A.5.1.3 输精步骤 保定好发情母牛， 输精员左手呈锥形， 沾 湿手臂伸入直肠， 刺激肛门括约肌， 送风排出宿粪， 将 子 宫颈握于掌心固定。用肘臂压开阴裂，右手将输精器或输精枪自下而上插入阴道，避开尿道口后展平， 左右手配合， 对 准子宫颈口使输精器前端达到输精部位， 徐徐输出精液。 输 完抽出输精器或输精枪， 尔 后用左手轻轻按摩子宫颈和子宫体， 缓 抽左手，术 毕

26、。 若 发现努责等不利输精状况时， 应 待恢复常态 后 ， 予以输精，切忌粗暴操作。 A.5.1.4 输精器使用 凯苏式金属输精枪及外套应按使用说明正确操作。 胶球式输精器在抽出子宫颈前不得松开胶球，以免吸回精液。 栓塞式输精器严防身体碰撞内栓塞，避免精液过早输出。 A.5.2 授精标准 A.5.2.1 授精活力 冷冻精液在输精前解冻， 解 冻后立刻输精。 使用解冻后保存精液， 输 精前不必另行升温， 颗粒精 液 以保存 3 小时内为宜，最长不得超过 12小时。 细管精液不得超过 1 小时，授精前后必须检查精子活力，活力不得低于 0.3分。 A.5.2.2 授精量 颗粒冻精 1 2 粒， 其

27、中呈直线前进运动精子数不应少于 1,200万个； 细 管冻精 1 支， 其 中呈直线前 进 运动精子数不应少于 1,000万个。 A.5.3 授精时机 A.5.3.1 一次输精法 一个情期授精 1 次的，应在外观停止发情（拒绝爬跨）后 12小时内输精； 3 5 小时内授精，情期受 胎率最高。青年牛和营养好的母牛，可在发情后立即输精。 A.5.3.2 二次输精法 一个情期输精 2 次者， 可 在母牛外观发情后 （接受爬跨） 8 12小时输第 1 次精， 间 隔 8 12小时输 第 2 次。也可早上发情，下午输第 1 次，翌晨输第 2 次。下午发情，翌日输第 1 次，同日下午输第 2 次。 A.5

28、.3.3 根据卵泡发育输精 采用直肠触模卵泡发育， 输精应在卵泡壁薄， 胀 而软， 富有弹性， 波动明显， 接近排卵前输精 1 次 ， 如经 8 12小时卵泡仍未破裂可再授精 1 次，直检到排卵为止。 A.6 妊娠诊断 授精后经过 60 天无重复发情者可判为妊娠。 A.6.1 应用激发试验 输精后第 16 17天，肌肉注射 5 8 毫克雌激素（苯甲酸求偶二醇，乙稀雌酚），注射后 3 天不发情 者，可判早期妊娠。 A.6.2 直肠检查 通过直肠检查卵巢和子宫角的形状、质地变化来判定是否妊娠。 授精后 20 30 天，排卵侧卵巢有明显的妊娠黄体存在可确定妊娠。 授精后 40 60 天，排卵侧卵巢有

29、妊娠黄体，且两子宫角不对称，角间沟稍平坦，空角收缩明显， 孕角无收缩反应，体积较空角增大 1 1.5倍，质地柔软有绵柔液体感，状如扁园软的长带水袋，可判 为妊娠。 DB63/T 454.5 2004 7 A.6.3 其他诊断 实验室用宫颈粘液煮沸法和眼球结膜血管变化进行妊娠诊断。 A.7 表格记载和统计 A.7.1 母牛繁殖情况登记 应按记录表逐头登记、每牛 1 张，要在配种当时逐项认真填写，并长期存档备查。牛改冷配繁殖情 况统计表，在配种结束和翌年产犊后，统计填报。 A.7.2 记录统计公式 总受胎率 总受胎母牛数 总输精母牛数 100% (1) 情期受胎率第一次输精后受胎母牛数 第一次输精

30、母牛头数 100% (2) 流产率流产母牛数 受胎母牛数 100% (3) 产犊率产犊数 受胎母牛数 100% (4) 犊牛死亡率犊牛死亡数 产犊数 100% (5) 犊牛成活率产后 4 个月断奶犊牛数 犊牛数 100% (6) 冷配繁殖成活率杂种犊牛断奶数 总输精母牛数 100% (7) 牛改繁殖成活率杂种牛犊断奶数 适龄母牛数 100% (8) A.8 液氮容器的使用 A.8.1 液氮罐的检查 启用新购入的容器， 应 检查外部有无凹陷或其它异常情况，内 部有无异物， 是 否清洁。 若 罐外挂 霜 ， 液氮蒸发量超过基准值时，应查明原因，及时更换和维修。 A.8.2 液氮的充填和补充 充填时

31、， 先 用少量液氮对容器进行预冷， 让罐内已蒸发氮气顺利排出， 充 氮以颈管底部为限。 存 有 冻精时，液氮在残留 1/3时应予补充。 A.8.3 冻精的提取和转移 贮存冻精的提筒， 按号扣入定位槽内， 提 取时不要扭曲提筒杆， 提筒不能超过颈管 1/3（ 10厘米） ， 时间为 10秒钟。 如 经 10秒钟尚未取放完毕， 应 将提筒或其它包装浸入液氮中， 再行提取。 冷 冻精液从 一 容器转移到另一容器， 速 度要快， 时间不能超过 5 秒， 如 需过长时间， 操作应在浸泡液氮的状态下进行 。 A.8.4 运输 A.8.4.1 贮存冻精容器移动 应要小心轻放，不可碰撞、冲击、倾斜、倒置和重叠

32、堆放。 A.8.4.2 车辆运输 除利用原保护套外，应加木箱或其它保护装置，铺垫要厚软，适当加以固定，以防颠波冲撞。 A.8.4.3 长途运输 途中应注意液氮消耗，做到及时补充。 A.8.5 液氮罐的冲洗 液氮罐在配种结束后最少清洗 1 次，常年使用的应更换清洗。 A.8.5.1 第一步 打开盖塞， 取 出提筒， 把冻精转移到其它液氮罐中， 倒 出液氮及其它残留物， 然后在室内放置 2 天 ， 使容器内部温度回升到 0 。 A.8.5.2 第进二步 用 40 50 温水，配以中性去垢剂（洗衣粉也可）注入容器内部，尔后用布擦洗干净，倒出污水。 A.8.5.3 第三步 DB63/T 454.5 2

33、004 8 用清水冲洗数次， 干净为止。 倒 置容器， 使其干燥。 干燥可采用自然风干和热风吹干， 若用热风 吹 干，热风温度不能超过 50 。 A.8.5.4 冷配受胎率评定效果 应以第一情期受胎率指标为准， 受 胎可根据 60天不再发情母牛的比例作为情期受胎率， 也 可用直 肠 妊娠检查来确定。 表 1 母牛配种登记表 表 2 母牛繁育登记表 牛号 发情时间 与配 公牛 配种情况 母牛健康 状况 孕检情况 配种员签 名月 日 时 时间 （日时） 精子活力 输精量 （ ml） 时间 结果 母牛号 母 父 出生年 月日 配种情况 预产期 产犊 备注 时间 与配公 牛 次数 发情未 配 公 母

34、注：预产期推算 “ 见月减 3 ，见日加 6 ” 。 DB63/T 454.5 2004 9 附 录 B （规范性附录） 奶牛胚胎移植技术操作规程 B.1 术语 B.1.1 胚胎移植 (embyotransfer)： 将良种母畜配种后的早期胚胎取出， 移 植到另一头同种的生理状态相同的母畜体内， 使 之继续发 育成一个新个体的技术。 B.1.2 供体母牛 (donor) 提供胚胎的良种母牛。 B.1.3 受体母牛 (recipient) 接受胚胎的生理状态相同的母牛。 B.1.4 超数排卵 (superovulatlon) 母畜一般只排出一个卵子，应用激素使母畜一次排出几个甚至几十个卵子。 B

35、.2 供体母牛及供精公牛要求 B.2.1 供体母牛 供体牛应符合本品种标准，具有较高的生产性能。供体牛年龄一般为 37岁，胎次为 9 5 胎，体 格健壮， 无遗传性疾病， 繁殖机能正常。 产犊记录清楚， 没有流产病史， 产后 60天以上， 有两次正常 发 情记录。 生殖器官正常， 不 得患有子宫内膜炎、 卵巢囊肿和子宫过度弛缓、 下垂等疾病， 长期空怀的 母 牛不得作供体。 2 次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。黄体发育不良，卵巢静止的母牛不用。应选 择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。 B.2.2 供精公牛 用于人工授精的冷冻精液一定要保证质量， 必 须符合 牛冷冻精液国家标准 。 每 次

36、授精剂量可 以 加倍。 B.3 超数排卵 B.3.1 药品 牛专用超数排卵激素 Follitrophin和氯前列烯醇 (PG)。 B.3.2 超排程序 B.3.2.1 超排前处理 牛超数排卵的处理程序一般采用连续 4 5 天、 以 逐渐递减的剂量每天早晚注射 FSH二次。 在 母牛 发 情周期的第 9 13天 ( 发情当天为第 0 天 ) 的任何一天开始第一次注射。在第 6 次或第 7 次注射 FSH的 同 时 ， 肌注 PG 3 支 (0 6mg)。 成 年奶牛采用促卵泡素进行超排处理为例， 将 400mg促卵泡素用 20ml生理盐水 稀 释混匀，在成母牛发情后第 10天开始注射，总剂量为

37、360mg(18m1)，具体注射程序见表 1 。 表 1 母牛超数排卵处理程序 发情周期 10 11 12 13 14 15 16 早晨 FSH FSH FSH FSH DB63/T 454.5 2004 10 B.3.2.2 人工授精 供体牛注射 PG后，应密切观察发情。供体牛一般在注射 PG后 48小时发情 ( 范围为 24-72小时 ) 。发情 后需进行 2 3 次人工授精。供体牛发情 6 10小时，进行第一次人工授精；间隔 10 12小时后，进行第 二次人工授精。如实行 3 次授精，则再间隔 10 12小时后，进行第三次人工授精。人工授精的最适时间 参照表 2 。 表 2 工授精的时间

38、 B.3.2.3 冲卵程序 供体牛超排发情后的第 7 天采用二路式冲卵管进行非手术冲卵。 首 先将供体牛在保定架保定， 并 用 2 的普鲁卡因或利多卡因在尾椎硬膜外麻醉。 利 多卡因剂量为 5 10ml。 用 子宫颈黏液去除器吸除黏液 。 在助手的协助下， 将 带钢芯的冲卵管插入阴门， 达 到子宫颈口。 用 直肠把握法将冲卵管插入子宫颈和 子 宫角。 当 冲卵管到达子宫角弯曲处时， 拔出一小部分钢芯， 将 冲卵管往前送。 当钢芯再次到达子宫角 弯 曲处时， 再 拔出一小部分钢芯， 将冲卵管往前送， 直 到冲卵管到达子宫角前端为止。 用 20ml的注射器 给 冲卵管气囊充气约 12 18ml。拔

39、出钢芯，联结三通管 ，进行冲卵。 B.3.2.4 检卵和胚胎标准 将冲出液体立即送入实验室检卵，检出可用胚胎。 B.3.2.5 胚胎分级标准 表 3 胚胎的分级标准 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度， 发 情后第 7 8d 回收的受精卵在正常发育时应 处 于致密桑椹胚至囊胚阶段 , 凡在 16 细胞以下的受精卵及变性细胞超过 1/2 的胚胎均属等外。 B.4 胚胎冷冻 B.4.1 冷冻前处理 胚胎检出后，经卫生处理，装管进行冷冻 B.4.1.1 乙醇为冷冻保护液的胚胎装管方法 8:00 9:00 3ml 2.5ml 2ml 1.5ml 人工 PG 发情 授精 3 支 晚上 FSH FS

40、H FSH FSH 人工 人工 20:00:21:00 ml ml ml ml 授精 授精 发情时间 第一次人工授精 第二次人工授精 早晨 当天下午 第二天早晨 中午 当天晚上 第二天中午 晚上 第二天早晨 第二天晚上 1 级胚胎 胚胎形态完整，轮廓清晰，处于正常的发育阶段，外形匀称， 胚胎呈球形，分裂球细胞 大于均件匀，结构紧凑，透明度适中，无附着的细胞和液泡，没有或只有少量游离细胞。 2 级胚胎 轮廓清晰， 色调和细胞密度良好， 可见到一些附着的细胞和液泡， 变 性细胞约占 10%-30%，发育稍迟缓， 有 少量游离细胞，（ 少于 20%） ， 细胞团完整， 胚 胎仍呈球形， 细 胞之间结

41、合紧 密 。 3 级胚胎 轮廓不清晰 , 色调发暗 , 结构较松散 , 发育迟缓 1-2天，卵裂球大小不均匀，透明度变化明 显 （太暗或太明）， 胚胎游离细胞较多，（ 大于 20%， 小于 50%），变性 细 胞 达 30%-50%,细胞联 结 不够紧密，但胚胎仍呈球形，有明显的细胞团结构。 注： 1 级、 2 级胚胎可用于鲜胚移植和冷冻保存； 3 级胚胎只能用于鲜胚移植，不能用于冷冻保存； 4 级 胚胎为不可用胚胎。检出的可用胚胎应尽快冷冻保存或移植。 DB63/T 454.5 2004 11 吸人约 3cm保存液、 0.5cm气泡、 0.5cm冷冻液、 0.5cm气泡、适量冷冻液及一枚胚胎

42、、 0.5cm气 泡 、 0.5cm冷冻液、 0.5cm气泡， 适量保存液。 即五段液体、 四个气泡， 边上两段液体为保存液， 中间三段 为 冷冻液。 B.4.1.2 甘油为冷冻保护液的胚胎装管方法 用 0.25ml的 专 用 细 管 ，吸人 约 4cm长 的 保 存 液 、 0.5cm长 的 气 泡 、适量 保 存 液 及 胚 胎 、 0.5cm气 泡 、 4cm 保存液，装管后为三段液体夹二段气泡，中间一段液体存放胚胎。 B.4.1.3 冷冻细管的标记 在胚胎细管上， 应标记生产单位、 品种、 公母牛号、 胚胎编号、 冷冻方法、 胚胎发育期与级别、 胚 胎数量和生产日期。一般制作一个标签，

43、贴在细管封口塞上。 B.4.2 胚胎冷冻 将冷冻仪的冷冻室预冷至植冰温度 ( 甘油冷冻液为 -6.5 ，乙二醇冷冻液为 -5.5 ) ，将装有胚胎 的细管放人冷冻室，平 衡 5 10分 钟 ， 植冰 ， 再平 衡 5 10分 钟 ，然后 以 0.3 分钟的降温速率降温至 -35 或 -32 ，平衡 10分钟后，将细管投入液氮保存。 B.5 受体牛的选择标准 受体牛应有正常的两个以上发情周期； 无繁殖机能疾病，无传染病 ( 特别是布氏杆菌病 ) ；身体 健 康， 膘 情在七成以上 ( 如按进级膘情分级， 应以 3 4 级为宜 ) ； 牛 龄为 3 6 岁； 经 产牛分娩在六十天 以 上；产犊性能

44、和泌乳性能良好；人工授精两次或胚胎移植两次不孕者不使用；无流产史；上胎无难产、 助产情况； 性情温顺者； 子宫弹性厚薄正常者； 黄体达到 A 、 B 级者； 青年牛达到 16 月龄以上， 体重 达 到成年母牛体重的 75。 B.6 移植前处理 B.6.1 受体牛的饲养管理 B.6.1.1 受体牛在移植前 45天开始补饲， 保 持日增重 0.30-0.40kg日。 在 移植前 6-8周注射 VA、 B 、 D 、 E 针剂，补充微量元素，如硒、锌等。 B.6.1.2 受体牛单独组群饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。 B.6.2 牛胚胎移植的适宜季节 放牧型牛移植季节应选在 8 11 月，舍饲

45、牛应避开最冷最热的季节，其它季节也可进行移植。 B.6.3 受体牛的发情鉴定 应对受体牛跟群观察， 以 受体牛稳定站立接受其它牛爬跨为发情标准。 并 准确记录开始站立接受 爬 跨的时间 ( 以小时为单位记录 ) 。 对发情母牛需做直肠检查，判断是否排卵，若在发情后 36h以后排卵的母牛不能作受体母牛。 B.6.4 受体牛的同期发情技术 同期化处理之前对受体牛进行直肠检查， 检 查卵巢是否处于活动状态。 处 于活动状态的牛方可进 行 同期化发情处理。 B.6.4.1 药品 氯前列烯醇 (PG)0.2mg 2ml支。 B.6.4.2 剂量 经产牛 0.4mg次，育成牛 0.3mg次。 B.6.4.

46、3 处理方法 B.6.4.3.1第一次肌注，在任意一天。 B.6.4.3.2第二次肌注，在第一次注射后 11天。第二次注射后 24 96小时观察发情。受体牛发情之日 计为 0 天， 6 8 天内进行胚胎移植。 B.7 胚胎解冻和移植 DB63/T 454.5 2004 12 B.7.1 受体牛移植操作步骤 移植前对受体奶牛进行直肠触摸， 检 查黄体是否合格， 合格者用一移植， 否 则不移植。 受体奶牛 在 1 2 尾椎间埂膜外麻醉，擦拭外阴部。 对照供体奶牛采配记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 B.7.1.1 胚胎的解冻 B.7.1.1.1解冻液的配备 将 10、 6 和 3

47、 甘油的 PBS ( 培养液 ) 保存液，用 0.22 m 滤器灭菌，分装在小培养皿内，第 1 杯为含 10甘油的 PBS保存液，第 2 杯为含 6 甘油的 PBS保存液，第 3 杯为含 3 甘油的 PBS保存液，第 4 杯为不含甘油的 PBS保存液。 B.7.1.1.2胚胎解冻方法 用乙二醇做冷冻保护液的胚胎可直接将细管装入移植枪立即移植，应在 5 分钟内移植给受体牛。 用甘油做冷冻保护液的胚胎先用三步法脱除甘油，再将胚胎用保存液洗涤 5 次，按 “ 三、胚胎的冷 冻 ” 中的方法重新装入细管， 装移植枪进行移植， 把 装有细管的移植枪套上硬外套， 用塑料环卡紧， 再 套上软外套，将胚胎移植

48、到受体有黄体一侧子宫角的上 1 3 1 2 处。 B.7.1.1.2.1一步解冻法 冷冻胚胎细管从液氮中取出在 20 空气浴 10s，投放到 35 水浴浸 10s。 B.7.1.1.2.2三步平衡法冻胚解冻 B.7.1.1.2.2.1胚胎解冻 胚胎从液氮中取出在 3s内投入 35 水浴浸 10s。 B.7.1.1.2.2.2三步脱甘油 用 70酒精棉球消毒解冻后塑料吸管和剪刀刀 刃，剪去棉塞端， 与带有空气的 lml注 射 器 连 接 上 。 再剪去吸管的另一端，在室温下将胚胎推人 10甘油和 0.3mol L 蔗糖 PBS保存液中，放置 5min，以后 陆续移人 6 和 3 甘油蔗糖的 PB

49、S保存液中，各放置 5min，最后移至不含甘油的 PBS保存液中镜检待用。 B.7.2 胚胎观察 用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜， 通 过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的形态和位置， 确 定 后用 70酒精棉球消毒并切除吸管上层 1cm，切口要平整，可直接用于移植。 B.8 胚胎的鉴定 B.8.1 在 100 200倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密 度、与透明带的间隙以及变性情况等。 B.8.2 凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。 B.8.3 胚胎的发育阶段：通常受精后 6 8d非手术回收的正常受精卵发育有六种情况。 B.8.3.1 桑椹胚 发情后第 5 6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分。 B.8.3.2 致密桑椹胚 发情后第 6 7d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔 60 70。 B.8.3.3 早期囊胚 发情后 7 8d回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔 70 80，难以 分清内细胞团和滋养层。 B.8.3.4 囊胚 发情后第 7 8d回收，内细胞团和滋养 1 层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。 B.8.3.5