DB37 T 1828-2011 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术.PDF
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1、ICS 65.020.30 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/ T 18282011 猪流行性乙型脑炎 RT-PCR 检测技术 RT-PCR Assay for the Detection of Swine Epidemic Encephalitis B 2011 - 04 - 08 发布 2011 - 06 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/ T XXXXXXXX I 前 言 本标准的编制依据GB/T 1.1-2009的规定。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本
2、标准主要起草人:王金宝 丛晓燕 吴家强 李俊 杜以军 时建立 孙文博。 DB37/ T XXXXXXXX 1 猪流行性乙型脑炎 RT-PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术的操作要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。 2 实验室生物安全要求 实验室必须为生物安全级(BSL-2级)以上实验室。 3 试剂 3.1 变性液: 见附录 A.1。 3.2 2M 醋酸钠溶液(pH4.0): 见附录 A.2。 3.3 水饱和酚(pH 4.0) 3.4 氯仿/异戊醇混合液: 见附录 A.3。 3.5 AMV 反转录酶(200 U/ L)。 3.6 RNA 酶
3、抑制剂(40 U/ L)。 3.7 Taq DNA 聚合酶(5 U/ L)。 3.8 1.0% 琼脂糖凝胶: 见附录 A.4。 3.9 50TAE 缓冲液: 见附录 A.5。 3.10 溴化乙锭(10 g/L): 见附录 A.6。 3.11 加样缓冲液: 见附录 A.7。 3.12 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水: 见附录 A.8。 3.13 5反转录反应缓冲液: 见附录 A.9。 3.14 2.5mmol/L dNTPs: 见附录 A.10。 3.15 10PCR Buffer: 见附录 A.11。 3.16 DNA 分子量标准 2000bp。 3.17 Eagles液。 3.18
4、 引物: DB37/ T XXXXXXXX 2 上游引物P1:5-ATCCTGGC TATGCTTTCCT-3; 下游引物P2: 5-CTCTGTTTC TCCACGCTGT-3; 扩增片断长度819bp。 4 操作程序 4.1 样品的采集和处理: 4.1.1 样品的采集 流产胎儿脑组织、发病公猪精液或蚊子,置于-20或液氮中保存。 4.1.2 样品的处理 4.1.2.1 组织样品处理:取待检脑组织病料 0.5g 或公猪精液 200 L,加入 400 L 变性液混匀研磨。取 已研磨好的待检组织样品上清 200 L,置 1.5mL 灭菌离心管中,加入 200 L 变性液,混匀。 4.1.2.2
5、蚊子样品处理:从-20冰箱或液氮罐中取出蚊子样品,倒入研磨器,加入 1 mL Hank S液清 洗,吸出液体在研磨器中加入 1 mL Eagles 液,将蚊虫样品研磨成匀浆。将研磨液约 1 mL 吸入离心管, 4 12 000rpm 离心 20 min。上清液用 0.22 m 规格的滤器过滤,备用。 4.1.2.3 阳性对照处理:取乙脑病毒弱毒疫苗 200 L, 置 1.5mL 灭菌离心管中,加入 200 L 变性液, 混匀。 4.1.2.4 阴性对照处理:取健康猪脑组织或精液 200 L,置 1.5mL 灭菌离心管中,加入 200 L 变性液, 混匀。 4.2 RNA 的提取 4.2.1 设
6、立阳性、阴性样品对照。 4.2.2 异硫氰酸胍一步法 4.2.2.1 向组织或细胞中加入 200 L 变性液,匀浆。 4.2.2.2 将匀浆混合物移至新的 1.5mL 离心管中,向每毫升变性液中立即加入 100 L 乙酸钠、1mL 酚、 200L 氯仿-异戊醇。加入每种试剂后,盖上试管盖,倒置混匀。 4.2.2.3 将匀浆混合物剧烈振荡 10s,冰浴 15min。 4.2.2.4 上述匀浆混合物 12000rpm,4离心 20min,将上层水相移入新的 1.5mL 离心管。 4.2.2.5 加入等体积的异丙醇,充分混匀,于-20沉淀 RNA 至少 1h。 4.2.2.6 4 12000rpm
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