1、ICS 65.020.30 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/ T 18282011 猪流行性乙型脑炎 RT-PCR 检测技术 RT-PCR Assay for the Detection of Swine Epidemic Encephalitis B 2011 - 04 - 08 发布 2011 - 06 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/ T XXXXXXXX I 前 言 本标准的编制依据GB/T 1.1-2009的规定。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本
2、标准主要起草人：王金宝 丛晓燕 吴家强 李俊 杜以军 时建立 孙文博。 DB37/ T XXXXXXXX 1 猪流行性乙型脑炎 RT-PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术的操作要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。 2 实验室生物安全要求 实验室必须为生物安全级（BSL-2级）以上实验室。 3 试剂 3.1 变性液： 见附录 A.1。 3.2 2M 醋酸钠溶液(pH4.0)： 见附录 A.2。 3.3 水饱和酚（pH 4.0） 3.4 氯仿/异戊醇混合液： 见附录 A.3。 3.5 AMV 反转录酶（200 U/ L）。 3.6 RNA 酶
3、抑制剂(40 U/ L)。 3.7 Taq DNA 聚合酶(5 U/ L)。 3.8 1.0% 琼脂糖凝胶： 见附录 A.4。 3.9 50TAE 缓冲液： 见附录 A.5。 3.10 溴化乙锭(10 g/L)： 见附录 A.6。 3.11 加样缓冲液： 见附录 A.7。 3.12 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水： 见附录 A.8。 3.13 5反转录反应缓冲液： 见附录 A.9。 3.14 2.5mmol/L dNTPs： 见附录 A.10。 3.15 10PCR Buffer： 见附录 A.11。 3.16 DNA 分子量标准 2000bp。 3.17 Eagles液。 3.18
4、 引物： DB37/ T XXXXXXXX 2 上游引物P1：5-ATCCTGGC TATGCTTTCCT-3； 下游引物P2: 5-CTCTGTTTC TCCACGCTGT-3； 扩增片断长度819bp。 4 操作程序 4.1 样品的采集和处理： 4.1.1 样品的采集 流产胎儿脑组织、发病公猪精液或蚊子，置于-20或液氮中保存。 4.1.2 样品的处理 4.1.2.1 组织样品处理：取待检脑组织病料 0.5g 或公猪精液 200 L，加入 400 L 变性液混匀研磨。取 已研磨好的待检组织样品上清 200 L,置 1.5mL 灭菌离心管中，加入 200 L 变性液，混匀。 4.1.2.2
5、蚊子样品处理：从-20冰箱或液氮罐中取出蚊子样品，倒入研磨器，加入 1 mL Hank S液清 洗，吸出液体在研磨器中加入 1 mL Eagles 液，将蚊虫样品研磨成匀浆。将研磨液约 1 mL 吸入离心管， 4 12 000rpm 离心 20 min。上清液用 0.22 m 规格的滤器过滤，备用。 4.1.2.3 阳性对照处理：取乙脑病毒弱毒疫苗 200 L, 置 1.5mL 灭菌离心管中，加入 200 L 变性液， 混匀。 4.1.2.4 阴性对照处理：取健康猪脑组织或精液 200 L，置 1.5mL 灭菌离心管中，加入 200 L 变性液， 混匀。 4.2 RNA 的提取 4.2.1 设
6、立阳性、阴性样品对照。 4.2.2 异硫氰酸胍一步法 4.2.2.1 向组织或细胞中加入 200 L 变性液，匀浆。 4.2.2.2 将匀浆混合物移至新的 1.5mL 离心管中，向每毫升变性液中立即加入 100 L 乙酸钠、1mL 酚、 200L 氯仿-异戊醇。加入每种试剂后，盖上试管盖，倒置混匀。 4.2.2.3 将匀浆混合物剧烈振荡 10s，冰浴 15min。 4.2.2.4 上述匀浆混合物 12000rpm，4离心 20min，将上层水相移入新的 1.5mL 离心管。 4.2.2.5 加入等体积的异丙醇，充分混匀，于-20沉淀 RNA 至少 1h。 4.2.2.6 4 12000rpm
7、离心 10min，弃上清，用 75%的乙醇洗涤沉淀，离心，彻底弃去上清，自然条 件下干燥沉淀，溶于 50 LDEPC 处理的水中,-20贮存，备用。 4.2.3 也可选择市售商品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。 4.3 反转录 4.3.1 反转录 20 L 体系 表1 RNA 5L 反转录引物 1L 2.5mmol /L dNTPs 2L DB37/ T XXXXXXXX 3 70作用5min，冰浴2min。 4.3.2 继续加入 表2 5反转录酶反应缓冲液 4L AMV反转录酶 0.8L RNA酶抑制剂 0.5L DEPC水 6.7L 瞬时离心后，于42温度下处理45min，再
8、以95灭活10min。取出后直接进行PCR，或置于-20保 存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。 4.4 PCR PCR为50 L体系，包括： 表3 双蒸灭菌水 37.5L 反转录产物 4L 上游引物 0.5L 下游引物 0.5L 10PCR Buffer 5L 2.5mmol dNTPs 2L Taq酶 0.5L 首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬， 瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为955min，94 30s，54 45s，72 1min，循环30 次，72延伸10min结束，设立阳性对照和阴性对照。 4.5 也可选择市售
9、商品化 RT-PCR 试剂盒，完成反转录聚合酶链反应。 4.6 电泳 4.6.1 制备 1.0%琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。 4.6.2 取5 L PCR 产物与 0.5 L 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 4.6.3 加入分子量标准。 4.6.4 盖好电泳仪，插好电极，5V/cm 电压电泳，3040min。 4.6.5 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档，打印。 4.6.6 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。 5 结果判定 5.1 在阳性对照出现 819bp 扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立。 5.2 被检样品出现 819bp 扩增带判定为猪流行性乙型脑炎病毒阳性
10、，未出现相应扩增带的样品判定为 猪流行性乙型脑炎病毒阴性。 DB37/ T XXXXXXXX 4 A A 附 录 A （资料性附录） 相关试剂的配制 A.1 变性液 4M 异硫氰酸胍 25mM 柠檬酸钠.2H2O 0.5%（m/V）十二烷基肌酸钠 0.1M -巯基乙醇 具体配制：将250g异硫氰酸胍、0.75M（ PH7.0）柠檬酸钠1 7.6ml和26.4ml 10%（m/V）十二烷基 肌酸钠溶于293ml水中。65条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次临用前按每50ml 变性液加14.4 mol/L的 -巯基乙醇0.36ml的剂量加入。变性液可在室温下避光保存数月。 A.2
11、2mol/L醋酸钠溶液(pH4.0) 表A.1 乙酸钠 16.4 g 冰乙酸 调 pH 至 4.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.3 氯仿/异戊醇混合液 表A.2 氯仿 49 mL 异戊醇 1 mL A.4 1.0%琼脂糖凝胶的配制 表A.3 琼脂糖 1.0 g 0.5TAE电泳缓冲液 加至100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50-60时，加溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固 后取下梳子，备用。 A.5 50TAE电泳缓冲液 A.5.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(ED TA)溶液 (pH8.0) DB37/ T XXXXXXXX 5 表A.4 二水乙二铵四乙
12、酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.5.2 TAE电泳缓冲液(50 )配制 表A.5 羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(PH8.0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至 1 000 mL 用灭菌双蒸水稀释使用。 A.6 溴化乙锭（EB）溶液 表A.6 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 加至20 mL A.7 10加样缓冲液 表A.7 聚蔗糖 25 g 灭菌双蒸水 100 mL 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g A.8 DEPC水 表A.8
13、超纯水 100 mL 50L 室温过夜，121高压15min，分装到1. 5 mL DEPC处理过的微量管中。 A.9 AMV 反转录酶 5 反应缓冲液 DB37/ T XXXXXXXX 6 表A.9 1moL Tris-HCl (pH 8.3) 5 mL KCl 0.559 g MgCl2 0.029 g DTT 0.154 g 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.10 2.5mmol/L dNTP 表A.10 dATP(10mmol/L) 20 L dTTP(10mmol/L) 20 L dGTP(10mmol/L) 20 L dCTP(10mmol/L) 20 L A.11 10PCR缓冲液 表A.11 1M Tris-HCl (pH8.8) 10 mL 1M KCl 50 mL Nonidet P40 0.8 mL 1.5moL MgCl2 1 mL 灭菌双蒸水 加至 100 mL _
