DB35 T 1872-2019 鸭3 型腺病毒病诊断技术.pdf
《DB35 T 1872-2019 鸭3 型腺病毒病诊断技术.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB35 T 1872-2019 鸭3 型腺病毒病诊断技术.pdf(12页珍藏版)》请在麦多课文档分享上搜索。
1、ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 18722019 鸭3型腺病毒病诊断技术 Diagnostic technique for duck adenovirus 3 infection 2019 - 12 - 19发布 2020 - 03 - 19实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 18722019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 缩略语.1 3 疫病概述.1 4 临床诊断.1 5 PCR诊断.1 6 结果判定.3 附录A(规范性附录) 试剂的配制.4 附录B(资料性附录) PCR检测结果电泳图.6 附录C(资料性附录) 参
2、考序列.7 DB35/T 18722019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位:福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人:万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、 傅秋玲、陈珍、朱春华。 DB35/T 18722019 1 鸭 3 型腺病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定。 本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文
3、件。 DAdV-3:鸭3型腺病毒(Duck Adenovirus 3) PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline) Tris:三羟甲基氨基甲烷(Trihydroxymethyl Aminomethane) 3 疫病概述 根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses)的最新分类: 腺病毒科(Adenoviridae)下设5个属,分别为富AT腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属 (Aviadenovir
4、us)、鱼腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和唾液 酸酶腺病毒属(Siadenovirus)。 鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄内雏番鸭,临床表现为肝脏肿大、出血,脾脏肿大,胆囊肿大, 肾脏肿大、出血。流行病学调查表明,该病发病率20%50%,病死率60%70%。 4 临床诊断 4.1 剖检病变 当鸭出现以下肉眼可见病变时,可作为初步诊断的依据之一: a) 肝脏肿大,表面呈点状或斑状出血; b) 脾脏肿大; c) 胆囊肿大; d) 肾脏肿大,表面出血。 4.2 初步诊断 当鸭出现4.1中剖检病变之一时,可做出初步诊断;确诊需进行实验室诊断
5、。 5 PCR诊断 5.1 主要仪器设备 主要仪器设备如下: DB35/T 18722019 2 a) PCR仪; b) 高速台式冷冻离心机; c) 微量移液器; d) 组织匀浆器; e) 电泳仪; f) 电泳槽; g) 紫外凝胶成像系统。 5.2 试剂 主要试剂如下: a) 10%十二烷基硫酸钠(配置方法按照附录A中A.1的规定); b) 蛋白酶K(10 mg/mL)(配置方法按照附录A中A.2的规定); c) 异丙醇; d) Tris饱和酚; e) 酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1); f) 乙酸钠(3 mol/L,pH5.4); g) 无水乙醇; h) 75%乙醇(配置方法按照附录A
6、中A.3的规定); i) 核糖核酸酶(20 mg/mL); j) 灭菌双蒸水; k) PBS(0.01 M)(配置方法按照附录A中A.4的规定)。 5.3 引物 根据DAdV-3的Fiber 2基因设计特异性引物,序列如下: 上游引物DAdV-3F:5-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3。 下游引物DAdV-3R:5-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3。 预期目的片段大小为548 bp。 5.4 核酸DNA 提取 5.4.1 酚氯仿法提取核酸DNA 5.4.1.1 取2 g组织(肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物),加入6 mL PBS(0.01M)进行研磨处理, 反复冻
7、融3次,4 000 r/min离心15 min,小心吸取上层水相作为组织匀浆液。 5.4.1.2 取420 L组织匀浆液和30 L核糖核酸酶加入1.5 mL灭菌离心管混匀后,室温作用20 min。 5.4.1.3 加入40 L 10%的十二烷基磺酸钠溶液和10 L蛋白酶K溶液,56 水浴2 h。 5.4.1.4 加入等量的Tris饱和酚,颠倒充分混匀,12 000 r/min离心5 min,小心吸取上层水相于 另一1.5 mL灭菌离心管中。 5.4.1.5 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1),颠倒充分混匀,12 000 r/min离心5 min,小 心吸取上层水相于另一1.5 m
8、L灭菌离心管中。 5.4.1.6 加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后,-20 放置1 h。12 000 r/min 离心15 min,去上清。加入600 L 冰冻预冷的75%乙醇清洗2次,倒置于吸水纸上5 min,室温晾干。 加入20 L灭菌双蒸水溶解沉淀,-20 放置备用。 DB35/T 18722019 3 5.4.2 试剂盒法提取核酸DNA 可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒,按照说明书完成核酸DNA提取。 5.5 对照 以纯化的DAdV-3基因组DNA为阳性对照;以灭活的其他鸭源病毒基因组DNA为阴性对照;以灭菌双蒸 水为空白对照。 5.6 PCR扩增
- 1.请仔细阅读文档,确保文档完整性,对于不预览、不比对内容而直接下载带来的问题本站不予受理。
- 2.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
- 3、该文档所得收入(下载+内容+预览)归上传者、原创作者;如果您是本文档原作者,请点此认领!既往收益都归您。
下载文档到电脑,查找使用更方便
5000 积分 0人已下载
下载 | 加入VIP,交流精品资源 |
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB35 1872-2019 鸭3 型腺病毒病诊断技术 1872 2019 病毒 诊断 技术