1、ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 18722019 鸭3型腺病毒病诊断技术 Diagnostic technique for duck adenovirus 3 infection 2019 - 12 - 19发布 2020 - 03 - 19实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 18722019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 缩略语.1 3 疫病概述.1 4 临床诊断.1 5 PCR诊断.1 6 结果判定.3 附录A（规范性附录） 试剂的配制.4 附录B（资料性附录） PCR检测结果电泳图.6 附录C（资料性附录） 参
2、考序列.7 DB35/T 18722019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、 傅秋玲、陈珍、朱春华。 DB35/T 18722019 1 鸭 3 型腺病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定。 本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文
3、件。 DAdV-3：鸭3型腺病毒（Duck Adenovirus 3） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane） 3 疫病概述 根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses）的最新分类： 腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属 （Aviadenovir
4、us）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液 酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。 鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄内雏番鸭，临床表现为肝脏肿大、出血，脾脏肿大，胆囊肿大， 肾脏肿大、出血。流行病学调查表明，该病发病率20%50%，病死率60%70%。 4 临床诊断 4.1 剖检病变 当鸭出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 肝脏肿大，表面呈点状或斑状出血； b) 脾脏肿大； c) 胆囊肿大； d) 肾脏肿大，表面出血。 4.2 初步诊断 当鸭出现4.1中剖检病变之一时，可做出初步诊断；确诊需进行实验室诊断
5、。 5 PCR诊断 5.1 主要仪器设备 主要仪器设备如下： DB35/T 18722019 2 a) PCR仪； b) 高速台式冷冻离心机； c) 微量移液器； d) 组织匀浆器； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像系统。 5.2 试剂 主要试剂如下： a) 10%十二烷基硫酸钠（配置方法按照附录A中A.1的规定）； b) 蛋白酶K（10 mg/mL）（配置方法按照附录A中A.2的规定）； c) 异丙醇； d) Tris饱和酚； e) 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）； f) 乙酸钠（3 mol/L，pH5.4）； g) 无水乙醇； h) 75%乙醇（配置方法按照附录A
6、中A.3的规定）； i) 核糖核酸酶（20 mg/mL）； j) 灭菌双蒸水； k) PBS（0.01 M）（配置方法按照附录A中A.4的规定）。 5.3 引物 根据DAdV-3的Fiber 2基因设计特异性引物，序列如下： 上游引物DAdV-3F：5-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3。 下游引物DAdV-3R：5-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3。 预期目的片段大小为548 bp。 5.4 核酸DNA 提取 5.4.1 酚氯仿法提取核酸DNA 5.4.1.1 取2 g组织（肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物），加入6 mL PBS（0.01M）进行研磨处理， 反复冻
7、融3次，4 000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相作为组织匀浆液。 5.4.1.2 取420 L组织匀浆液和30 L核糖核酸酶加入1.5 mL灭菌离心管混匀后，室温作用20 min。 5.4.1.3 加入40 L 10%的十二烷基磺酸钠溶液和10 L蛋白酶K溶液，56 水浴2 h。 5.4.1.4 加入等量的Tris饱和酚，颠倒充分混匀，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上层水相于 另一1.5 mL灭菌离心管中。 5.4.1.5 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12 000 r/min离心5 min，小 心吸取上层水相于另一1.5 m
8、L灭菌离心管中。 5.4.1.6 加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20 放置1 h。12 000 r/min 离心15 min，去上清。加入600 L 冰冻预冷的75%乙醇清洗2次，倒置于吸水纸上5 min，室温晾干。 加入20 L灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 放置备用。 DB35/T 18722019 3 5.4.2 试剂盒法提取核酸DNA 可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，按照说明书完成核酸DNA提取。 5.5 对照 以纯化的DAdV-3基因组DNA为阳性对照；以灭活的其他鸭源病毒基因组DNA为阴性对照；以灭菌双蒸 水为空白对照。 5.6 PCR扩增
9、5.6.1 PCR反应体系为50 L，每个反应管的反应液配置为：依次加入5 L 10PCR缓冲液，1 L 上/下游引物（引物浓度均为20 M）、4 L dNTP Mixture（各2.5 mM）、2 L提取的基因组DNA、 36.5 L灭菌双蒸水、0.5 L Taq聚合酶。2 000 r/min离心15 s。将上述反应混合液按照以下步骤 进行PCR扩增，94 预变性5 min；循环参数为94 变性50 s，55 退火30 s，72 延伸35 s， 循环35次；第三步72 再延伸10 min结束。 5.6.2 也可采用市售商品化的等效PCR预混液检测试剂盒，并按照市售商品化的试剂盒推荐的条件进
10、行。 5.7 PCR产物电泳 PCR扩增反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置于2 8 冰箱保存。分别取5 L PCR扩增 产物与0.5 L 10加样缓冲液（配置方法按照附录A中A.5的规定）混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶 （配置方法按照附录A中A.6的规定）板的加样孔中，加上DNA分子量标准5 L，以5 V/cm的电压进行 电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果。 6 结果判定 6.1 实验成立的条件 当阳性对照出现约548 bp的特异性条带（参见附录B图B.1中1号泳道）、阴性对照无扩增条带（参 见附录B图B.1中2号泳道），空白对照无扩增条带（参见附录B图B.1中3号泳道）
11、，实验结果成立。 6.2 实验结果判定 当待检样品出现约548 bp条带（参见附录B图B.1中4号泳道），可判定为阳性；当待检样品无特异 性扩增条带（参见附录B图B.1中5号泳道）判为阴性。必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待 测样品的测序结果和参考序列（参见附录C）进行核苷酸同源性比较，同源性在98.0%以上判为阳性。 DB35/T 18722019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 10%十二烷基硫酸钠 将10 g十二烷基硫酸钠溶于80 mL灭菌双蒸水中，调节溶液的pH值至7.2，定容至100 mL，室温保存 备用。 A.2 蛋白酶K（10 mg/mL） 将
12、蛋白酶K（20 mg/mL）和灭菌水按照体积比1:1配置，使用前现用现配。 A.3 75%乙醇 取无水乙醇750 mL加入灭菌双蒸水250 mL，定容至1 000 mL，-20 保存备用。 A.4 PBS（0.01 M） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL灭菌双蒸水中，定容至1 000 mL，1.03410 5 Pa高压灭菌30 min，4 保 存备用。 A.5 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 灭菌双蒸水 定容至100 mL A.6 1.0%琼脂糖凝胶
13、琼脂糖 1.0 g 1TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.7的规定） 定容至100 mL 置微波炉中加热至完全融化，待冷至50 60 时，加溴化乙锭溶液（配制方法按照A.8的规 定）5 L，摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 DB35/T 18722019 5 A.7 1TAE电泳缓冲液 50TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.9的规定） 20 mL 灭菌双蒸水 定容至1 000 mL。 A.8 溴化乙锭溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 定容至20 mL 说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染料。 A.9 50TAE电泳缓冲液 Tris 242
14、g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 100 mL 灭菌双蒸水 定容至1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。 DB35/T 18722019 6 B B 附 录 B （资料性附录） PCR检测结果电泳图 PCR检测结果电泳图如图B.1所示。 说明： M DNA分子量标准； 1 阳性对照（鸭3型腺病毒）； 2 阴性对照（灭活的其他鸭源病毒）； 3 空白对照； 4 待检样品（鸭3型腺病毒阳性）； 5 待检样品（阴性）。 图B.1 PCR检测结果电泳图 M 1 2 3 4 5 bp 2000 1000 750 500 250 100 bp 54
15、8 DB35/T 18722019 7 C C 附 录 C （资料性附录） 参考序列 鸭3型腺病毒参考序列： ACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCAT ACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCG TGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGC
16、GCTGAGGATGCATCACATGC TGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCC ACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAAT GTTTCAGAACATGACTTTATTCTGTATAACTATAGTGGGGTAAACACATCAGGAGTTCCAATAGGCACAGGGAACCTAAAGAATGTGTA TGATTACGTATCAAGATT _ DB35/T18722019 福建省地方标准鸭3型腺病毒病诊断技术DB35/T 18722019*2019年12月第一版2019年12月第一次印刷
